 |
A DNS-beli uracil prevenciójában, javításában, fenntartásában és esetleges jelátviteli szerepében fontos útvonalak kapcsolata
|
súgó 
nyomtatás 
|
Ezen az oldalon az NKFI Elektronikus Pályázatkezelő Rendszerében nyilvánosságra hozott projektjeit tekintheti meg.
vissza »
|
| |
Projekt adatai |
|
|
| azonosító |
119493 |
| típus |
K |
| Vezető kutató |
Vértessy G. Beáta |
| magyar cím |
A DNS-beli uracil prevenciójában, javításában, fenntartásában és esetleges jelátviteli szerepében fontos útvonalak kapcsolata |
| Angol cím |
Crosstalk among pathways for prevention, repair, tolerance and potential signaling of uracil-DNA |
| magyar kulcsszavak |
DNS hibajavítás, uracil-DNS, dUTPáz, uracil-DNS glikoziláz, Drosophila, genommérnökség |
| angol kulcsszavak |
DNA damage and repair, uracil-DNA, dUTPase, uracil-DNA glycosylase, Drosophila, genome engineering |
| megadott besorolás |
| Molekuláris Biológia (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma) | 70 % | | Ortelius tudományág: Molekuláris biológia | | Általános biokémia és anyagcsere (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma) | 30 % | | Ortelius tudományág: Biokémia |
|
| zsűri |
Molekuláris és Szerkezeti Biológia, Biokémia |
| Kutatóhely |
Molekuláris Élettudományi Intézet (HUN-REN Természettudományi Kutatóközpont) |
| résztvevők |
Barta Endre
Békési Angéla
Benedek András
Erdélyi Miklós
Hajdú Fanni
Hiripi László
Hirmondó Rita
Kelemenné Dr. Nagy Kinga
Kiss János
Koppány Gergely
Leveles Ibolya
Marton Lívia
Nagy Gergely Nándor
Nyíri Kinga
Olasz Ferenc
Pálinkás Hajnalka Laura
Pancsa Rita
Papp-Kádár Veronika
Róna Gergely
Szabó Judit Eszter
Tóth Judit
Zagyva Imre
|
| projekt kezdete |
2016-10-01 |
| projekt vége |
2021-03-31 |
| aktuális összeg (MFt) |
47.672 |
| FTE (kutatóév egyenérték) |
29.22 |
| állapot |
lezárult projekt |
magyar összefoglaló A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
A nukleotid metabolizmus és DNS szintézis útvonalai minden sejt számára létfontosságúak. Szabályozásuk sokrétű, annak a fontos igénynek megfelelve, hogy a genetikailag kódolt információ stabil tárolása és hű továbbadása biztosítva legyen. A kanonikus négy bázison kívül, további módosított DNS-alkotó bázisok is jelen lehetnek a legtöbb szervezetben, például epigenetikai módosításként, vagy DNS károsodás eredményeként. A jelen pályázat fő fókusza a DNS-beli uracil szerepe különböző állati modellszervezetekben (Drosophila, egér) és humán sejtvonalakban. Külön figyelmet fordítunk a DNS-beli uracil szintjének dinamikus változásaira az egyedfejlődés során, illetve más releváns körülmények hatására. Specifikus célkitűzéseink:
1. Célkitűzés. Humán tumor sejtvonalakon megvalósítjuk a dUTPáz bi-allélikus génkiütését genommérnökségi technológiáz használva. Az így megjelenő fenotípust olyan izogenikus sejtvonalakban fogjuk vizsgálni, melyek genetikai háttere a DNS javító rendszerekre nézve különböző. Egér modellszervezetben az irodalomban először megvalósítjuk a dUTPáz kiütését CRISPR technológiával.
2. Célkitűzés. Transzgén Drosophila törzseket fogunk kialakítani és használni in vivo enzimológiai tanulmányokra.
3. Célkitűzés. Vizsgálataink érdekében releváns és hatékony módszert fogunk kidolgozni az uracil-DNS szekvenálására saját felfedezéseink alapján kialakított jól tervezett uracil-szenzor fehérjékből és harmadik generációs nanopórusos technikából kiindulva.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
A javasolt kutatás főbb munkahipotézisei:
A megfelelő irodalmi háttér és saját korábbi megfigyeléseink és eredményeink alapján, jelen pályázatunkban az alábbi munkahipotéziseket fogjuk vizsgálni:
Az 1. munkahipotézis szerint a dUTPáz deficiencia által kiváltott, a nukleotid szintek megváltozásában tapasztalt zavaró hatás többféle sejtbeli választ idézhet elő, a különböző DNS javító útvonalak közötti kommunikáció révén. Ennek megvizsgálását a leginkább adekvát, a DNS javító útvonalakra nézve különböző izogenikus humán tumor sejtvonalakban, továbbá egér modellszervezetben fogjuk vizsgálni.
A 2. munkahipotézis szerint az Drosophila egyedfejlődés során tapasztalt DNS-beli uracillal szembeni toleranciát a Drosophilában életfontosságú dUTPáz és számos egyéb releváns faktor közötti kölcsönhatás határozza meg. Ezt transzgénikus Drosophila vonalak fenotípusos analízisével fogjuk vizsgálni.
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
Vizsgálataink több fontos modellszervezetben fogják felfedni az uracil-DNS szerepét és dinamikáját. Ezen belül várható, hogy mélyebb bepillantást nyerünk majd arra, hogy milyen módon valósulhat meg az egyes DNS javító útvonalak együttes szerepe a nukleotid szintek megzavarása során fellépő hatásokra adott sejtválaszban különböző genetikai hátterű izogenikus humán tumor sejtvonalakban, és egér modellszervezetben. Kísérleteink során bevezetjük a Drosophila modellorganizmust, mint az in vivo enzimológia megfelelő modelljét, és vizsgálni fogjuk a dUTPáz és az uracil-DNS megjelenését és szerepét a Drosophilában zavaró anyai hatás kiküszöbölése mellett is. Ezeken a területeken komoly kihívást jelentenek a tervezett kutatások, de sikeres előkísérleteink és a projekt megvalósításában résztvevő tapasztalt kutatók tudására támaszkodva ezek megvalósíthatóak lesznek, és jelentős új eredmények várhatók. Az 1. célkitűzésben vázolt munkáról fontos megemlíteni, hogy a lényegi fő kísérletsorozat (dUTPáz biallélikus génkiütés menekítő génkópia egyidejű bevitele mellett) előkísérleteinkban sikeresen megvalósítottuk a HCT116 sejtvonalon, így itt is bízva állíthajuk, hogy a további munka nehéz lesz, de megoldható. A 3. célkitűzés során uracil-DNS genomi szekvenálását tervezzük, egyrészt nemrég kifejlesztett egyedi uracil-szenzor fehérjéinkre alapozva, másrészt a nanopórusos MinION rendszer innovatív felhasználásával. Ez a célkitűzés a „high risk – high yield” osztályba sorolandó, mert még nincsenek konkrét eredményeink arra nézve, hogy az uracil specifikus és azonosítható jelet ad. Mégis, a gödöllői Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóintézet munkatársainak kiterjedt bioinformatikai és genomszekvenálási tapasztalata, és a MinION rendszer fejlesztésében való nemzetközi részvétele alapján valószínűsíthető, hogy megoldást fogunk találni. A DNS hibajavítás és a DNS hibák meghatározása nemzetközileg is fontos, kompetitív terület, ebben helyzeti előnyünket sikeres előkísérleteink alapozzák meg.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
A nukleotid metabolizmus és DNS szintézis útvonalai minden sejt számára létfontosságúak. Szabályozásuk sokrétű, annak a fontos igénynek megfelelve, hogy a genetikailag kódolt információ stabil tárolása és hű továbbadása biztosítva legyen. A szokatlan bázisok megjelenését a DNS-ban hagyományosan csak hibaként értelmezték az irodalomban, de a közelmúlt éveiben némely ilyen szokatlan DNS-alkotó esetén további esetlegesen fontos szerepet is tanulmányoztak. Kutatási projektünk esetén fontos kiemelni, hogy tervezett tanulmányaink sokrétűen kapcsolódnak jelentős orvosbiológiai kihívásokhoz. Ezen belül vizsgálni fogjuk a rákellenes kemoterápiában fontos sejthalál útvonalakat. Itt célunk az, hogy le tudjuk írni ezek pontos működését, és így a kemoterápia fejlesztésében fontos ismereteket szerezzünk. Célunk az is, hogy a DNS-beli uracil pontos pozícióinak megállapítására nagy áteresztő képességű genomszekvenálási módszert fejlesszünk.
| angol összefoglaló Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
Nucleotide metabolism and DNA synthesis are key processes in all cells and are under multiple levels of regulation to ensure faithful storage and transmission of genetic information. In addition to the canonical four bases, additional modified DNA bases may also be present in most organisms, e.g. as a result of epigenetic modifications or DNA damage. The main focus of our current proposal is the role of uracil-DNA in different animal model organisms (Drosophila, mouse) and in human tumor cell lines, with a special interest on the dynamic changes along development or in different relevant conditions. Our specific aims are:
AIM 1 We will perform bi-allelic inducible gene knockout of dUTPase in human tumor cell lines by genome engineering and will investigate the resulting phenotype in cell lines with different background of DNA repair factors. We will also generate dut-/- knockout in mouse using CRISPR and will investigate the resulting defects during development.
AIM 2 We will employ a variety of transgenic Drosophila strains that will also serve as a prime model to conduct in vivo enzymology studies of both human and Drosophila dUTPases.
AIM 3 To support our studies with relevant and efficient methodology, we will employ our recently developed U-sensor constructs linked to ChIP sequencing as well as nanopore sequencing to follow occurrence and pattern of uracil moieties in genomic DNA.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
The working hypotheses of the project :
Based on the background inthe field and our preliminary observations and results, the central working hypothesis of the present grant application are as follows:
Working hypothesis 1 states that nucleotide pool imbalances induced by dUTPase deficiency may elicit cellular response in various DNA damage pathways, and the response includes communication between the different pathways. To investigate this, we will perform bi-allelic inducible gene knockout of dUTPase in human tumor cell lines by ZFN genome engineering and will investigate the resulting phenotype in cell lines with different background of DNA repair factors. We will also generate dut-/- knockout in mouse using CRISPR and will investigate the resulting defects during development.
Working hypothesis 2 states that tolerance to uracil-DNA is determined by a crosstalk between dUTPase, essential for viability in Drosophila, and several other factors during development. We will investigate this by phenotypic analysis of different transgenic Drosophila strains.
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
The planned studies will shed light on the presence and dynamics of uracil-DNSA in several models with strong biomedical interest. Specifically, our planned experiments in isogenic human cell lines of different background in DNA repair pathways will provide a better understanding of the crosstalk between DNA repair pathways in the cellular response to nucleotide pool imbalances. The dUTPase KO mouse model will be generated for the first time in the literature and will offer unique insight into the role of nuclotide pool control during development.
We will also introduce Drosophila as an apt model for in vivo enzymology and will reveal the role of dUTPase and uracil-DNA in direct systems (without maternal effects). Experiments in these fields are challenging, still, based on successful preliminary experiments and the combined state-of-the-art expertise of our team, I expect that we will be able to provide major novel results. In AIM 1, our preliminary experiments already confirmed that the bottleneck step, ie production of bi-allelic knock-out of the dUTPase gene and knock-in of the rescue dUTPase gene can indeed be achieved in the same cell clones. The following steps, although far from being routine tasks, are not expected to present major obstacles in our hands. In AIM 3, we wish to develop a uracil-detecting genome sequencing method based on our recent new uracil-sensor contstruct and the MinION nanopore technology. This is a high risk – high yield aim, since we do not yet have direct experimental indication that uracil will elicit a specific current flow alteration signal. However, based on the expertise of the genome sequencing laboratory of the Agricultural Biotechnology Institute, it is quite probable that we will find a way to this problem.
The field of DNA repair pathways and sequencing the positions of DNA errors constitutes an internationally highly competitive hot topic. Our promising key current publicatios and unpublished preliminary data offer us an important advantage to succeed ahead of the competitors.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
Nucleotide metabolism and DNA synthesis are key processes in all cells and are under multiple levels of regulation to ensure faithful storage and transmission of genetic information. The appearance of unusual bases in DNA has been traditionally considered as damage sites, however, in recent years, the potential additional significance of these moieties are also being appreciated. Importantly, the biomedical significance of our project is established in numerous different aspects. We will investigate cell death pathways in human tumor cell lines, with the perspective to better understand teh mechanism of action of frequently used chemotherapeutic anti-cancer drugs. We will develop a novel methodology to pinpoint the pattern of distribution of uracil, an unusual building block, in genomic DNA.
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
Közleményjegyzék |
|
|
| Pálinkás Hajnalka L, Békési Angéla, Róna Gergely, Pongor Lőrinc, Papp Gábor, Tihanyi Gergely, Holub Eszter, Póti Ádám, Gemma Carolina, Ali Simak, Morten Michael J, Rothenberg Eli, Pagano Michele, Szűts Dávid, Győrffy Balázs, Vértessy Beáta G: Genome-wide alterations of uracil distribution patterns in human DNA upon chemotherapeutic treatments., ELIFE 9: e60498, 2020 | | Békési Angéla, Holub Eszter, Pálinkás Hajnalka Laura, Vértessy Beáta G.: Detection of Genomic Uracil Patterns, INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES 22: (8) p. 3902., 2021 | | Rácz Gergely Attila, Nagy Nikolett, Tóvári József, Apáti Ágota, Vértessy Beáta G.: Identification of new reference genes with stable expression patterns for gene expression studies using human cancer and normal cell lines, SCIENTIFIC REPORTS 11: (1) 19459, 2021 | | Pálinkás Hajnalka L, Békési Angéla, Róna Gergely, Pongor Lőrinc, Papp Gábor, Tihanyi Gergely, Holub Eszter, Póti Ádám, Gemma Carolina, Ali Simak, Morten Michael J, Rothenberg Eli, Pagano Michele, Szűts Dávid, Győrffy Balázs, Vértessy Beáta G: Genome-wide alterations of uracil distribution patterns in human DNA upon chemotherapeutic treatments., ELIFE 9: e60498, 2020 | | Manikandan Periyasamy, Anup K Singh, Carolina Gemma, Christian Kranjec, Raed Farzan, Damien A Leach, Naveenan Navaratnam, Hajnalka L Pálinkás, Beata G Vértessy, Tim R Fenton, John Doorbar, Frances Fuller-Pace, David W Meek, R Charles Coombes, Laki Buluwela, Simak Ali: p53 controls expression of the DNA deaminase APOBEC3B to limit its potential mutagenic activity in cancer cells, NUCLEIC ACIDS RES 2017: Nucleic Acids Research, gkx721, https://doi.org/10.1093/nar/gkx721, 2017 | | Nikkila J, Kumar R, Campbell J, Brandsma I, Pemberton HN, Wallberg F, Nagy K, Scheer I, Vertessy BG, Serebrenik AA, Monni V, Harris RS, Pettitt SJ, Ashworth A, Lord CJ: Elevated APOBEC3B expression drives a kataegic-like mutation signature and replication stress-related therapeutic vulnerabilities in p53-defective cells, BRIT J CANCER -: , 2017 | | Hirmondo R, Lopata A, Suranyi EV, Vertessy BG, Toth J: Differential control of dNTP biosynthesis and genome integrity maintenance by the dUTPase superfamily enzymes, SCI REP 7: (1) , 2017 | | Kinga Nyíri, Beáta G. Vértessy: Perturbation of genome integrity to fight pathogenic microorganisms, BBA-GEN SUBJECTS 1861: (1) 3593-3612, 2017 | | Nagy GN, Suardiaz R, Lopata A, Ozohanics O, Vékey K, Brooks BR, Leveles I, Tóth J, Vértessy BG, Rosta E: Structural Characterization of Arginine Fingers: Identification of an Arginine Finger for the Pyrophosphatase dUTPases, J AM CHEM SOC 138: (45) 15035-15045, 2016 | | Andras Benedek, Istvan Poloskei, Oliver Ozohanics, Karoly Vekey, Beata G Vertessy: The Stl repressor from Staphylococcus aureus is an efficient inhibitor of the eukaryotic fruitfly dUTPase, FEBS OPEN BIO 8: (2) p. 158167. 10 p. , 2018 | | Guca E, Nagy GN, Hajdú F, Marton L, Izrael R, Hoh F, Yang Y, Vial H, Vértessy BG, Guichou JF, Cerdan R: Structural determinants of the catalytic mechanism of Plasmodium CCT, a key enzyme of malaria lipid biosynthesis, SCI REP 25: (8) Paper 11215. 13 p. , 2018 | | Nyiri K, Mertens HDT, Tihanyi B, Nagy GN, Kohegyi B, Matejka J, Harris MJ, Szabo JE, Papp-Kadar V, Nemeth-Pongracz V, Ozohanics O, Vekey K, Svergun DI, Borysik AJ, Vertessy BG: Structural model of human dUTPase in complex with a novel proteinaceous inhibitor, SCI REP 8: (1) Paper 4326. 15 p. , 2018 | | Surányi ÉV, Hírmondó R, Nyíri K, Tarjányi S, Kőhegyi B, Tóth J, Vértessy BG: Exploiting a phage-bacterium interaction system as a molecular switch to decipher macromolecular interactions in the living cell, VIRUSES 10: (4) Paper 168. 13 p. , 2018 | | Marton, L ; Hajdu, F ; Nagy, GN ; Kucsma, N ; Szakacs, G ; Vertessy, BG: Heterologous expression of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase from Plasmodium falciparum rescues Chinese Hamster Ovary cells deficient in the Kennedy phosphatidylcho, SCIENTIFIC REPORTS 8 Paper: 8932 , 8 p. (2018), 2018 | | Molnár, Petra ; Marton, Lívia ; Izrael, Richard ; Pálinkás, L Hajnalka ; Beáta, G Vértessy: Uracil moieties in Plasmodium falciparum genomic DNA, FEBS OPEN BIO 1 : 11 pp. 1-1772. Paper: 1 , 1772 p. (2018), 2018 | | Benedek Andras, Temesvary-Kis Fanni, Khatanbaatar Tamjidmaa, Leveies Ibolya, Suranyi Eva Viola, Szabo Judit Eszter, Wunderlich Livius, Vertessy Beata G.: The Role of a Key Amino Acid Position in Species-Specific Proteinaceous dUTPase Inhibition, BIOMOLECULES 9: (6) 221, 2019 | | Lopata Anna, Jójárt Balázs, Surányi Éva, Takács Enikő, Bezúr László, Leveles Ibolya, Bendes Ábris, Viskolcz Béla, Vértessy Beéta, Tóth Judit: Beyond Chelation: EDTA Tightly Binds Taq DNA Polymerase, MutT and dUTPase and Directly Inhibits dNTPase Activity, BIOMOLECULES 9: (10) p. 621., 2019 | | Nyíri K., Harris M.J., Matejka J., Ozohanics O., Vékey K., Borysik A.J., Vértessy B.G.: HDX and Native Mass Spectrometry Reveals the Different Structural Basis for Interaction of the Staphylococcal Pathogenicity Island Repressor Stl with Dimeric and Trimeric Phage dUTPases, BIOMOLECULES 9: (9) 488, 2019 | | Pálinkás Hajnalka, Rácz Gergely, Gál Zoltán, Hoffmann Orsolya, Tihanyi Gergely, Róna Gergely, Gócza Elen, Hiripi László, Vértessy Beáta: CRISPR/Cas9-Mediated Knock-Out of dUTPase in Mice Leads to Early Embryonic Lethality, BIOMOLECULES 9: (4) 136, 2019 | | Papp-Kadar Veronika, Balazs Zoltan, Vekey Karoly, Ozohanics Oliver, Vertessy Beata G.: Mass spectrometry-based analysis of macromolecular complexes of Staphylococcus aureus uracil-DNA glycosylase and its inhibitor reveals specific variations due to naturally occurring mutations, FEBS OPEN BIO 9: (3) pp. 420-427., 2019 | | Rácz Gergely A., Nagy Nikolett, Gál Zoltán, Pintér Tímea, Hiripi László, Vértessy Beáta G.: Evaluation of critical design parameters for RT‐qPCR‐based analysis of multiple dUTPase isoform genes in mice, FEBS OPEN BIO 9: (6) pp. 1153-1170., 2019 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
