Cell biophysical and genetic analysis of higher-order chromatin organization and homologous recombination in the model organism Saccharomyces cerevisiae
Magasabbrendű kromatin szerkezet és homológ rekombináció sejtbiofizikai és genetikai vizsgálata Saccharomyces cerevisiae-ben
Title in English
Cell biophysical and genetic analysis of higher-order chromatin organization and homologous recombination in the model organism Saccharomyces cerevisiae
Keywords in Hungarian
kromatin szerkezet, genetikai instabilitás, rekombináció, hiszton modifikációk
Cell genetics (Council of Medical and Biological Sciences)
100 %
Ortelius classification: Molecular genetics
Panel
Cellular and Developmental Biology
Department or equivalent
Department of Biophysics and Cell Biology (University of Debrecen)
Starting date
2011-09-01
Closing date
2014-11-30
Funding (in million HUF)
22.098
FTE (full time equivalent)
2.15
state
closed project
Summary in Hungarian
A sejtek életciklusa során, a kromoszómákon folyamatosan keletkeznek a DNS molekula egyik vagy mindkét szálát megszakító folytonossághiányok. A különféle - spontán, indukált vagy genetikailag programozott - DNS léziókat hatékony repair rendszerek javítják ki, amely rövidtávon lehetővé teszi a sérült sejt túlélését, hosszútávon pedig megakadályozza a kontrollálatlan sejtosztódás kialakulását. Közismert, hogy a rosszindulatú daganatok kialakulásában mind a genetikai rekombináció fehérjéinek a hibás működése, mind a kromatin egyes epigenetikai paramétereinek a megváltozása (pl. hiszton modifikációk) alapvető szerepet játszhatnak. Az élesztő (Saccharomyces cerevisiae) egy kiváló modell rendszer a rekombinációs folyamatok és a kromatin epigenetikai sajátságainak tanulmányozásához és mélyebb megértéséhez. Intézetünk kutatási profiljában és műszer infrastruktúrájában elsősorban a modern mikroszkópiás és citometriás módszerek dominálnak; az élesztő modell - mint jól karakterizált genetikai rendszer - a klasszikus genetikai manipulációkhoz, genetikai analízishez és egyéb génsebészeti technológiákhoz szükséges speciális szaktudás hiányában mindezidáig kiaknázatlan megközelítési lehetőség maradt. Kutatási programom a korábbi külföldi munkám során megszerzett professzionális élesztő genetikai ismeretanyagot és tapasztalatot ötvözi az itthoni, élvonalbeli biofizikai tudással. Jelen projekt célja a magasabb rendű kromatin szerkezet már ismert és még feltáratlan szintjeinek az analízise a legmodernebb sejtbiofizikai (pl. CLSM, FRET, FRAP, FLIM, LSC) és genetikai módszerek segítségével. Kísérleteinkben nagyszámú (>100), elsősorban hiszton-szubsztitúciós és hiszton modifikáló enzim deléciós mutáns és keresztezéssel létrehozott többszörös mutáns összehasonlító analízisét végezzük el. Kitüntetett figyelmet fordítunk a kromoszómális RNS-DNS hibridek (R-loop-ok), egyszál DNS törések és a homológ rekombináció molekuláris komponenseinek és összefüggéseinek a vizsgálatára. A létrehozott törzsekben megváltoztatjuk az endogén RNázH aktivítást (RNaseH1 knock out/RNaseH1 overexpressziós törzsek), illetve a replikációs origók számát és eloszlását (ori deléciós törzsek). Munkánk orvosbiológiai jelentősége abban áll, hogy a kromatin szerkezeti változásaira és a rekombináció zavaraira visszavezethető karcinogenetikus folyamatok legkorábbi - és reverzibilis - epigenetikai változásainak az azonosítása lehetőséget adna egy korai klinikai diagnózis felállítására és a folyamat terápiás visszafordítására.
Summary
Chromosomal DNA is liable to damage, constantly receiving single- or double-strand breaks during the lifecycle of a cell. In all cases, spontaneous or genetically programmed DNA lesions must be accurately repaired - in the short-term to allow the damaged cell to survive, and on the long run to prevent uncontrolled cell proliferation and preserve the integrity of genetic material for future cell generations. It is generally believed that mishaps in DNA recombination processes and/or different sorts of epigenetic changes (e.g. histone modifications) can lead to tumorigenesis. Budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) is an excellent model for studying the epigenetic features of chromatin and to get a deeper understanding in recombination processes operating in the chromatin context. Research infrastructures of our institute has been prevailed by advanced microscopic and cytometric platforms; in the absence of special expertise in genetic manipulations and analysis, yeast - as a genetically tractable model system - has been an unexploited facility. My research program aims to cross a solid expertise in yeast genetics - obtained abroad during my postdoctoral training – with state-of-the-art biophysical approaches available at the host institute. The goal of this project is to unravel the enigmatic layers of higher-order chromatin organization using advanced cell biophysical (e.g. CLSM, FRET, FLIM, LSC) and genetic techniques. A large number of (>100) single- and double-mutants – involving e.g. histone substitution mutagenesis and histone modifying enzyme deletions – will be analyzed, with a special emphasis on the effect of changing the cellular level of RNaseH (RNaseH1 knock out / RNaseH1 overexpression strains) and altering the number and distribution of replication origins along the chromosomes (ori deletion strains). We will also study in a mechanistic detail the potential link between the molecular components of genetic recombination and some peculiar DNA structures (e.g. R-loops, ribonucleoprotein-masked single-strand breaks). Our research have important medical implications: identifying the earliest - and reversible - chromatin structural epigenetic changes that lead to a recombination-mediated carcinogenetic process could result in an early diagnosis, opening up new ways to reverse the pre-malignant process using drug treatments that target histone modifications.
Final report
Results in Hungarian
A projekt célkitűzése a kromoszómatörések molekuláris komponenseinek az analízise volt élesztő modellszervezetben. Munkánk során nagy hangsúlyt fektettünk a DNS töréspontok biokémiai jellemzésére és az ismert ún. epigenetikai markerekkel történő korrelációk vizsgálatára. Célunk volt továbbá egy olyan genetikai eszköztár kifejlesztése is, amely a vizsgált komponensek korrelációján túl ok-okozati viszony feltárását is lehetővé teszi a molekuláris jellegek között. Kísérleteink egyik fő eredménye egy olyan rekombinációs modell megalkotása volt, amely megmagyarázza a meiotikus DNS dupla-szál törések beágyazottságát a magasabb rendű kromatin szerkezetbe.
Results in English
The objective of the project was to understand the molecular components of chromosomal breaks in the model organism budding yeast. In our investigations the biochemical characterization of DNA breakpoints and their correlation with known epigenetic markers was of special interest. We have developed a novel genetic tool that enables us to go beyond statistical correlation and find causality between the molecular traits analyzed. The main result of these studies is that a working model for recombination initiation was established that explain how meiotic DNA doube-strand break formation is embedded with higher-order chromatin architecture.
