Consortional assoc.: Mechanism of action and physiological role of the complement system: a comprehensive study based on in vitro evolved pathway-selective inhibitors
Konzorcium, társ p.: A komplementrendszer aktiválódási mechanizmusa és élettani szerepe: átfogó vizsgálat irányított evolúcióval kifejlesztett, útvonal-szelektív inhibitorokkal
Title in English
Consortional assoc.: Mechanism of action and physiological role of the complement system: a comprehensive study based on in vitro evolved pathway-selective inhibitors
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)
70 %
Ortelius classification: Biochemistry
Immunology (Council of Medical and Biological Sciences)
30 %
Ortelius classification: Immunology
Panel
Molecular and Structural Biology and Biochemistry
Department or equivalent
Institute of Molecular Life Sciences (Research Center of Natural Sciences)
Participants
Apáti, Ágota Beinrohr, László Cseh-Szilágyi, Katalin Dobó, József Kocsis, Andrea Major, Balázs Makó, Veronika Megyeri, Márton Oroszlán, Gábor Paréj, Katalin Sajó, Ráchel Sarkadi, Balázs
Starting date
2012-01-01
Closing date
2016-12-31
Funding (in million HUF)
48.804
FTE (full time equivalent)
19.34
state
closed project
Summary in Hungarian
Rövid ismertető, legfontosabb célkitűzések: A komplementrendszer a természetes immunitás egyik legfontosabb komponense. Ez a mintegy 30 fehérjemolekulából álló proteolitikus kaszkádrendszer képes felismerni, megjelölni és elpusztítani a fertőző mikroorganizmusokat és a megváltozott saját struktúrákat. A komplementrendszer normális működése elengedhetetlen az immunhomeosztázis fenntartásához, kontrollálatlan aktiválódása azonban súlyos betegségek kialakulásához vezethet. A komplementrendszer három különböző úton - a klasszikus, a lektin és az alternatív úton – keresztül aktiválódhat. Ahhoz, hogy meg tudjuk határozni, hogy az egyes aktiválódási utaknak mi a szerepe különböző fiziológiás és patológiás szituációkban, útvonal szelektív inhibitorokra van szükség. Nemrégiben sikerült kifejlesztenünk az első ilyen szelektív inhibitorokat, amelyek a lektin út indító proteázait, a MASP-1-et és a MASP-2-t, gátolják. Jelen pályázatban a következő célkitűzéseink vannak: 1.) Szelektív inhibitorok kifejlesztése a másik két aktivációs út, a klasszikus és az alternatív út ellen is. Az indító proteázokat (C1r és C1s klasszikus út; D faktor alternatív út) rekombináns formában fogjuk előállítani és különböző peptid- és fehérjevázakon inhibitorokat evolválunk ellenük fág részecskék felszínén. 2.) Az inhibitorok tesztelése enzimkinetikai és funkcionális szempontból. 3.) Az enzim-inhibitor komplexek kristályosítása és szerkezetük meghatározása röntgendiffrakcióval. 4.) Az iniciációs komplexek (pl. MBL-MASP, fikolin-MASP) sztöchiometriájának meghatározása fluoreszcensen jelölt inhibitorokkal (FRET, affinitás kromatográfia). 5.) Az egyes aktiválódási utak szívizompusztuláshoz való hozzájárulásának kvantitatív meghatározása szövettenyészet-alapú szívinfarktus modell és útvonalszelektív inhibitorok segítségével.
A kutatás alapkérdései: A kutatás alapkérdése a komplementrendszer működési mechanizmusának felderítése illetve a három különböző aktiválódási útvonal fiziológiás és patofiziológiás szerepének meghatározása. Ezeket a kérdéseket egy újszerű, eddig még senki más által nem alkalmazott módszerrel, útvonalszelektív inhibitorok kifejlesztésével és alkalmazásával akarjuk megválaszolni. A project során a következő konkrét kérdésekre kaphatunk választ: 1.) Mi a komplement proteázok rendkívül szűk szubsztrátspecificitásának szerkezeti alapja. 2.) Az iniciációs komplexek szerkezetének és az aktivációs mechanizmusnak a felderítése. A lektin út esetén még a komplexek (MBL-MASP, fikolin-MASP) összetételét sem ismerjük, nem tisztázott a MASP-1 és MASP-2 pontos szerepe az aktivációban. A klasszikus út C1 komplexéről több információ áll rendelkezésünkre, azonban a pontos szerkezet és aktivációs mechanizmus itt sem ismert. 3.) Az utóbbi időben felmerült, hogy az alternatív út és a lektin út szoros kapcsolatban áll egymással azáltal, hogy a MASP-1 aktiválja a D faktort. Ezt a kérdést rendkívül elegánsan meg tudnánk válaszolni szelektív inhibitorok használatával. 4.) A szívinfarktust követő sejtpusztulásért részben a komplementrendszer aktiválódása a felelős. Nem ismert azonban az egyes aktiválódási útvonalak relatív hozzájárulása a folyamathoz. Az őssejtekből differenciáltatott szívizom modell rendszer és a specifikus inhibitorok segítségével erre a kérdésre is válasz kaphatunk.
A kutatás jelentősége A komplementrendszer a természetes immunitás részeként alapvetően hozzájárul a fertőzések elleni védekezéshez és az immunhomeosztázis fenntartásához (pl. rákos, apoptotikus sejetek, immunkomplexek eltávolítása). Újabban egyre több olyan eredmény is napvilágot lát, amely a komplementrendszer egyéb, nem-immunológiai (pl. embriogenezis) szerepére utal. A komplementrendszer kontrollálatlan aktiválódása azonban betegségek kiváltó és/vagy súlyosbító tényezője lehet. A komplementrendszer fehérjéi ezért potenciális gyógyszercélpontok, eddig azonban csak monoklonális antitestek bizonyultak használható specifikus gátlószereknek. A fentiekből nyilvánvaló, hogy a komplementrendszer működési mechanizmusának felderítése és egyes aktiválódási lépések szelektív gátlása az alapkutatás mellett hatalmas gyakorlati haszonnal is kecsegtet. Pályázatunkban egy teljesen új, innovatív, eddig még mások által nem alkalmazott megközelítést használunk: az egyes komplement proteázok szelektív gátlását természetes inhibitorokból in vitro evolúciós technikával előállított inhibitor molekulákkal. A közelmúltban sikerült ilyen gátlószereket előállítanunk a lektin út indító proteázaival (MASP-1 és MASP-2) szemben és betekintést nyerhettünk az aktiválódás mechanizmusába. Az aktiválódási mechanizmus olyan alapvetően fontos részleteire sikerült fényt derítenünk, amelyeket eddig más módszerrel nem lehetett megközelíteni. Ha mindhárom aktiválódási út ellen rendelkeznénk szelektív inhibitorokkal, akkor a működési mechanizmus részletes feltárása mellett, pontosan megbecsülhetnénk az egyes aktiválódási utak hozzájárulását a különböző betegségek patogeneziséhéz és célzott terápiás szerek, illetve eljárások kifejlesztésére is megnyílna a lehetőség. A munkának a pályázatban felvázolt fázisa elsősorban alapkutatási jelentőségű, melynek eredményeire egy későbbi gyógyszerfejlesztési projekt épülhet.
Summary
Summary including key goals The complement system is an important component of the innate immunity. This proteolytic cascade system consists of about 30 proteins and it can recognize, label and eliminate the pathogen microorganisms and altered self structures. An intact complement system is required for maintaining the internal inflammatory homeostasis, however its improper, enhanced or uncontrolled activation can lead to serious disease conditions. The complement system can be activated via three different activation pathways: the classical, the lectin and the alternative routes. In order to determine the specific role of the individual activation routes in different physiological and pathological processes we need pathway-selective complement inhibitors. Recently, we managed to develop the prototypes of the pathway-selective inhibitors: inhibitors that specifically block the activity of MASP-1 and MASP-2, the initiator proteases of the lectin pathway. The objectives of the present project proposal are as follows: 1.) We aim to develop selective inhibitors against the other two activation pathways: the classical- and the alternative pathways. The initiation proteases (C1r and C1s in the case of the classical pathway; factor D in the case of the alternative pathway) will be expressed recombinantly and various peptide- and protein scaffolds will be used in phage display based inhibitor evolution studies. 2.) The enzymological and functional properties of the inhibitors will be tested in in vitro experiments. 3.) The enzyme-inhibitor complexes will be crystallized and the structures will be determined by X-ray diffraction. 4.) We aim to determine the stoichiometry and structure of the initiation complexes of the lectin pathway (MBL-MASPs; ficolin-MASPs) by using fluorescently labeled inhibitors (FRET, affinity chromatography). 5.) We aim to quantitatively assess the selective contribution of individual complement activation pathways to cardiac tissue damage using pathway selective inhibitors and a tissue culture based myocardial infarct model.
Research questions The basic aim of this research is to reveal the mechanism of action of the complement system and to determine the physiological and pathological role of the individual activation routes. In order to reach this goal we will apply a new, unique approach: we will develop pathway selective inhibitors. We have the following questions to be answered in course of the project: 1.) What is the structural background of the extremely narrow substrate specificity of the complement proteases? 2.) What is the structure of the initiation complexes and how does the activation take place? In the case of the lectin pathway we don’t even know the composition of the MBL-MASPs/ficolin-MASPs complexes, and we do not know the exact role of MASP-1 and MASP-2 in the activation process. In the case of the classical pathway we have more information regarding the structure of the components, however the detailed structure of the complex and the activation mechanism are also debated. 3.) Recently, it was proposed that the alternative and lectin pathways are closely related since MASP-1 might activate factor D. Using selective inhibitors we can elegantly decide whether this statement is true or false. 5.) The three pathways contribute to different extent to pathological complement activation. Lack of selective inhibitors frustrated all efforts to decipher the significance of the individual activation pathways in complement related pathological states such as in the massive tissue damage upon cardiac attack. We can quantitatively assess this by using pathway selective inhibitors in a myocardial tissue based model system.
Significance of the research The complement system, as a part of the innate immune system, significantly contributes to the protection against infections and to the maintenance of immune homeostasis through eliminating cancer cells, apoptotic cells and immune complexes. Recently, new results have been published indicating the role of the complement system in non-immunological processes, such as embryogenesis. Uncontrolled activation of the complement system however can contribute to the development and/or maintenance of disease conditions. The components of the complement system are potential drug targets, but only monoclonal antibodies have been developed as specific inhibitors. It is obvious that revealing the mechanism of action of the complement system and selective inhibition of certain activation steps can be a breakthrough both in basic research and in drug development. In our project we propose a unique, innovative approach: to selectively inhibit the individual complement proteases by means of molecules, that will be produced by in vitro evolution (phage display) of naturally existing inhibitor-scaffolds. Recently, we managed to produce such inhibitors against the initiation proteases of the lectin pathway (MASP-1 and MASP-2) and we gained insight into the activation mechanism. We revealed several important details of the activation process that have been impossible to study by using conventional approaches. If we develop selective inhibitors against all three activation pathways, besides revealing the details of the activation mechanism, we could quantitatively asses the contribution of the individual activation pathways to the pathogenesis of different diseases and we can open up the possibility to develop new, effective therapeutic agents and methods. The present project proposal is mainly basic research that can form the background of a subsequent drug development process.
