oligopeptidases, conformational selection, protein crystallography, molecular modelling
Discipline
Organic, Biomolecular, and Pharmaceutical Chemistry (Council of Physical Sciences)
70 %
Ortelius classification: Molecular modelling
Structural biology (crystallography and EM) (Council of Medical and Biological Sciences)
30 %
Panel
Chemistry 2
Department or equivalent
Institute of Chemistry (Eötvös Loránd University)
Starting date
2012-01-01
Closing date
2015-06-30
Funding (in million HUF)
6.469
FTE (full time equivalent)
2.50
state
closed project
Summary in Hungarian
Három oligopeptidáz, a disznó, az Aeropyrum pernix (ApAAP), és a Pyrococcus horikoshii (PhAAP) acilaminoacil peptidáz (AAP), szubsztrát kötésének és működési mechanizmusának vizsgálatát tervezzük fehérjekrisztallográfiai és számítási módszerekkel. Emlős AAP kristályszerkezetét eddig nem sikerült meghatározni, az emlős enzim jelenleg hozzáférhető szerkezeti modelljei az ApAAP és PhAAP. Az ApAAP kristályszerkezetét először 2004-ben határozták meg, de a méretszelektivitás értelmezése szempontjából jelentős nyitott/csukott forma a mi csoportunk új felfedezése. A PhAAP szerkezetét szintén a közelmúltban, laboratóriumunkban határozták meg. Célunk hogy, az emlős AAP szerkezet-meghatározása mellett modell-enzimeinken tanulmányozzuk a méret-szelektivitási és katalitikus folyamat különböző fázisait a nyitott és csukott enzimformák peptidkomplexei, valamint aktív-hely mutánsok krisztallográfiai vizsgálatával. Molekuladinamikai számítások segítségével kívánjuk vizsgálni az AAP fehérjék flexibilitását és domináns mozgásait. Különböző AAP-k termék-szerű ligandumokkal képzett szerkezeteit felhasználva, molekulamodellezési módszerekkel kívánjuk rekonstruálni az enzim-szubsztrát komplex szerkezetét, majd ezt felhasználva QM/MM módszerrel vizsgálni a reakció mechanizmusát. Az eredmények egyrészt átfogó modell-rendszert hozhatnak létre a konformációs szelekciós kötődési mechanizmus vizsgálatára, másrészt lehetőséget nyújthatnak egy potenciális gyógyszer-célpont fehérje specificitásának és szabályozásának megértéséhez, amely egyben elmélyítheti a különböző családokba tartozó szerin proteázokra vonatkozó ismereteinket.
Summary
In this project we plan to study the substrate binding criteria and the reaction mechanism of three oligopeptidases: acylamnioacyl peptidase (AAP) from porcine liver, from Aeropyrum pernix (ApAAP) and from Pyrococcus horikoshii (PhAAP) - by protein crystallographic and theoretical methods. The crystal structure of mammalian AAP has not been determined yet, the other two AAPs represent the only two structural models of the mammalian enzyme. The crystal structure of ApAAP has been first determined in 2004, however its open / closed crystal form, which showed for the first time the principal structural changes required for substrate access to the active site, is a new discovery of our group. The structure PhAAP has also, only recently, been solved in our group. Beside the crystal structure analysis of the mammalian enzyme, we plan to study the different stages of the substrate screening and the catalytic process by structure determination of the peptide complexes of the open and closed forms of the enzyme as well as those of site-specific mutants. Molecular dynamics simulations are planned for the analysis of the dominant movements of the protein and regional flexibility. Based on the structure of product-like complexes, using molecular modeling tools, we also plan to reconstitute full-length substrates within the binding pocket and study the reaction mechanism by a QM/MM method. The expected results will, on one hand, present a detailed model system for the newly re-discovered phenomenon of conformational selection and, on the other hand, will also help to understand the specificity and regulation of a potential drug-target enzyme while broadening our understanding of the greater family that it is a member of, the serine-proteases.
Final report
Results in Hungarian
A jelen kutatás az acil-aminoacil peptidáz enzim (AAP) szubsztrát kötődési és szelekciós mechanizmusait kívánta felderíteni.
Sikerült igazolnunk, hogy flexibilis monomereket tartalmazó AAP enzimek esetében (ilyen az ApAAP) a szubsztrát kötési és hasítási lépésekért más enzim-formák felelősek – míg a kötődés megtörténhet a nyitott forma könnyen megközelíthető belső terében, a kötés-felszakítási – katalitikus – reakció egyedül a csukott formán belül játszódhat le. Merev, de oldalsó bejáratot tartalmazó monomerekből felépülő AAP enzimek (mint például a PhAAP) oligomerizálódnak, hogy egyidejűleg tudjanak megfelelni a hatékonyság és a szelektivitás kritériumainak. A oligomerek csatorna-rendszere felel azért, hogy olyan szubsztrátok melyek meghaladják az enzim méret-határát, ne juthassanak el a monomerek aktív helyéig.
Meghatároztuk (3 különböző formában) és analizátluk a hexamer PhAAP enzim szerkezetét, meghatároztuk 2 további formáját a dimer ApAAP enzimnek, melyek a szubsztrát-kötési folyamat részleteinek tisztázására adott módot, valamint sikerült mérhető kristályokat előállítanunk az emlős tetramer enzimből is, és az adatgyűjtés végrehajtanunk – a szerkezet megoldása folyamatban van. Részt vehettünk együttműködésekben is, ahol olyan fehérjéket vizsgálhattunk (podocint és egy minifehérjét) amelyek esetében az oligomerizáció szintén kontroll-folyamatként funkcionál, az aktív és inaktív formák közti választó-mechanizmusként.
Results in English
In this project we set out to gain a better understanding of the substrate binding and selection mechanisms of acyl-aminoacyl peptidase (AAP).
We could verify that in case of flexible monomers of the enzyme (like those of ApAAP) substrate binding and substrate cleaving steps are carried out by different forms - while substrate scavenging may take place in the easily-accessed cavity of the open form, the catalytic bond-breaking reaction is the exclusive task of the closed form. Rigid monomers, possessing a permanent side entrance (like PhAAP), multimerize to simultaneously maintain selectivity and effectiveness, forming a self-compartmentalized channel system that deselects substrates larger, or more structured than the size-limit of the enzyme.
During the project we determined (in three different forms) and analyzed the structure of a hexameric AAP from Pyrococcus horikoshii (PhAAP), determined two further forms of the dimeric ApAAP which helped elucidate its substrate binding process and obtained crystals of the tetrameric mammalian enzyme (of porcine liver – pAAP) that remained stable during the X-ray diffraction measurements and collected data of sufficient resolution for determining its structure. We also participated in collaborations concerning proteins where oligomerization also functions as a control mechanism, easily disrupted or enhanced, that can switch between their active and inactive forms: those of podocin and a Trp-cage miniprotein.
Dóra K. Menyhárd, Anna Kiss-Szemán, Éva Tichy-Rács, Balázs Hornung, Krisztina Rádi, Zoltán Szeltner, Klarissza Domokos, Ilona Szamosi, Gábor Náray-Szabó , László Polgár, and Veronika Harmat: A Self-compartmentalizing Hexamer Serine Protease from Pyrococcus Horikoshii SUBSTRATE SELECTION ACHIEVED THROUGH MULTIMERIZATION, Journal of Biological Chemistry, 2013
