A mikroRNS-ek szerepe a krónikus pankreatitisz diagnosztikájában és pathogenezisében
Title in English
The role of microRNAs in the diagnosis and pathogenesis of chronic pancreatitis
Keywords in Hungarian
mikroRNS, epigenetika, pankreatitisz
Keywords in English
microRNA, epigenetics, pancreatitis
Discipline
Public health, health services, environmental and occupational medicine, epidemiology, medical ethics
(Council of Medical and Biological Sciences)
60 %
Ortelius classification: Gastroenterology
Analysis, modelling and simulation of biological systems (Council of Medical and Biological Sciences)
40 %
Panel
Clinical Medicine
Department or equivalent
Dept. of Internal Medicine (Semmelweis University)
Starting date
2011-09-01
Closing date
2015-08-31
Funding (in million HUF)
26.147
FTE (full time equivalent)
3.20
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára:
Az idült pankreatitisz molekuláris pathomechanizmusa nem ismert, valamint biomarkerek sem állnak rendelkezésünkre, amelyek a korai diagnózist és a ráktól való elkölönítést szolgálnák. A mikroRNS-ek szerepét az elmúlt években számos sejten belüli folyamatban bizonyították, de a krónikus pankreatitiszben mikroRNS vizsgálatok még nem történtek a diagnosztikus és regulációs szerepük felderítésére. A tervezett kutatás három fő fázisra osztható: (1) miRNS markerek azonosítása mikroRNS microarray (Affymetrix) profilok segítségével plazma, és ennek megfelelő krónikus pankreatitisz szövetből (n=10), emellett plazma és megfelelő tumoros és szomszédos normál hasnyálmirigy rákos szövetekből (n=5), és normál mirigyből (n=2). Egészséges betegekből származó (n=5) plazma szerepelni fog kontrollként. (2) miRNS marker szelekció és 10 miRNS validáció kvantitatív valós-idejű PCR (qRT-PCR) segítségével 60 krónikus pankreatitiszben szenvedő beteg plazmájából (klinikai stádium meghatározás a M-ANNHEIM klasszifikáció segítségével), 15 pankreasz rákos, 15 gyulladásos bélbetegségben szenvedő és 30 egészséges egyén plazmáját kontrollként felhasználva. (3) az in silico analízissel előrejelzett miRNS-ek és célgénjeik expressziójának valamint az utóbbiak szabályozásának funkcionális analízise. A választott miRNS-ek expresszióját qRT-PCR segítségével, a regulált gén mRNS és fehérje termékének mennyiségét pedig qRT-PCR-el és immunhisztokémiával fogjuk elemezni. Végül, luciferáz vizsgálatokkal a vizsgált gén miRNS-ek általi szabályozását kívánjuk bizonyítani és a miRNS-ekkel való tranziens transzfekció után HeLa sejtekből a célfehérje szintjeit meghatározni.
Mi a kutatás alapkérdése?:
Kutatásaink fő kérdése, hogy plazma mikroRNS-ek alapján elkülöníthető-e a krónikus pankreatitisz a hasnyálmirigy adenokarcinomától és a normál mintáktól. Az irodalomban szereplő publikációk a két betegség szöveti hasonlósága miatt diagnosztikai nehézségeket írtak le. A vizsgálatokban egy új megközelítéssel, ugyanazon betegből plazma és szöveti minták miRNS microarray vizsgálatával, azonosíthatók azok a miRNS-ek, amelyek ténylegesen a hasnyálmirigy folyamatból származnak. Az miRNS-ek azonosítása után a meghatározott specifikus plazma markereket nagy mintaszámokon fogjuk validálni. Plazma miRNS vizsgálatokat a világon még nem végeztek krónikus pankreatitiszes betegek véréből, emellett a plazma-szövet összehasonlító analízis még a hasnyálmirigy rák vizsgálatában is új megközelítés, így a vizsgálatainktól értékes új miRNS profilok azonosítását várjuk. Minthogy a hasnyálmirigy minták nehezen elérhetőek, a humán krónikus pankreatitisz legjobb modellje a genetikailag meghatározott pankreatitisz, ami a megbetegedések kevesebb mint 5%-áért felelős. Más megközelítések, például a rohamosan fejlődő epigenetikai megközelítés a krónikus pankreatitisz kutatásában is új eredményeket adhat. A kutatás in silico és funkcionális fázisaiban miRNS célgéneket kívánunk azonosítani, a mikroRNS-ek szerepének bizonyítására a krónikus pankreatitisz pathomechanizmusában.
Mi a kutatás jelentősége?:
A jelen kutatási tervben a mikroRNS-ek szerepét tervezzük vizsgálni krónikus pankreatitiszben a betegségre jellegzetes mikroRNS expressziós mintázatok meghatározásával. Az idült hasnyálmirigy-gyulladás elhúzódó kórkép, amely a hasnyálmirigy szerkezetében és működésében helyrehozhatatlan károkat okoz, aminek krónikus fájdalom, cukorbetegség és egyes esetekben hasnyálmirigy adenocarcinoma az eredménye. Megfelelő specificitású és szenzitivitású mikroRNS detekción alapuló vértesztek kidolgozása különös jelentőségű ebben a betegségben a diagnosztika jelen korlátai miatt: korai tünetek hiánya és a mintavétel nehézségei, a mirigy retroperitoneális lokalizációja miatt. A betegségre jellemző specifikus mikroRNS expressziós elváltozások azonosítása új perspektívát nyithatnak a gyógyításban: (1) a krónikus pankreatitisz korai diagnózisához segíthetnek hozzá, (2) a betegség stádiumának és prognózisának pontos jövőbeli meghatározását segítheti a rendelkezésre álló egyéb módszerek mellett, (3) illetve támogatja a krónikus pankreatitisz és hasnyálmirigy rák elkülönítő kórisméjét. Ezek a mikroRNS vérmarkerek, amennyiben nagy mintaszámokon is megtörténik validációjuk, olcsó és nem invazív diagnosztikus elemei lehetnek a krónikus pankreatitisznek. A tervezett kutatások funkcionális sejtbiológiai kísérletei fontos miRNS-ek által szabályozott folyamatokra deríthetnek fényt, amelyek gyógyszeres befolyásolása a jövőben megvalósulhat.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára:
A krónikus pankreatitisz a hasnyálmirigy állományának fokozatos pusztulásával járó gyulladásos megbetegedés, amely elhúzódó lefolyása során a táplálék emésztésének és felszívódásának zavarához, valamint a cukorháztartás felborulásához, cukorbetegség kialakulásához vezet. A betegség fő tünete a sokszor elviselhetetlen fájdalom, ezért is sajnálatos, hogy a betegségnek oki terápiája még nincs. A hasnyálmirigy mintavételre nem alkalmas, és nem állnak rendelkezésre megfelelő tesztek a korai diagnózisra, ami komoly probléma, hiszen a krónikus pankreatitisz hasnyálmirigyrákká alakulhat, ami a legrosszabb indulatú rákok közé tartozik. Kísérleteinkben egy új markercsoportot keresünk, amelyek meghatározása a betegség korai diagnózisához segítené hozzá az orvosokat, illetve a betegség elkülönítését a rosszabb kimenetelű ráktól. A vizsgálat kevesebb, mint egy teáskanálnyi vérmintából képes lenne kimutatni, hogy a betegnek van-e hasnyálmirigy betegsége és milyen stádiumban van. Továbbá sejtbiológiai vizsgálataink új molekuláris célpontok azonosításához vezetnek, amelyek a betegség kezelésének új célpontjai lehetnek.
Summary
Summary of proposed research including key goals for scientifically qualified assessors:
The molecular basis of chronic pancreatitis is not understood and markers for the early diagnosis and for the differentiation from pancreatic cancer need to be defined. The role of microRNAs (miRNAs) in recent years has been shown in many cellular processes. However, description of the role and diagnostic utility of miRNAs in chronic pancreatitis is lacking. The proposed study will be divided into three phases: (1) miRNA marker discovery using microRNA microarray (Affymetrix) profiling on plasma, corresponding chronic pancreatitis tissue (n=10), along with plasma and corresponding cancerous and adjacent benign tissues from pancreatic cancer patients (n=5), and normal tissue (n=2). Plasma from healthy individuals (n=5) will serve as controls. (2) miRNA marker selection and validation of ten miRNA markers by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) on a large set of plasma from 60 patients with chronic pancreatitis (staging performed by the M-ANNHEIM classification), 15 patients with pancreatic cancer, 15 patients with inflammatory bowel disease and 30 healthy controls. (3) functional analysis of in silico predicted miRNA gene targets by expression analysis of the miRNA in question and the regulated mRNA/protein levels (qRT-PCR/ immunohistochemistry). Finally, a dual-luciferase assay to analyse gene regulation, and transient transfection of miRNAs into Hela cells followed by target protein detection (western blot) will be utilized.
What is your research question?:
Chronic pancreatitis (CP) a persistent inflammatory disorder characterized by destruction of the pancreas leading to digestive problems, chronic pain, diabetes mellitus, with frequent progression to pancreatic cancer. We plan to investigate whether plasma microRNAs could discriminate between patients with and without chronic pancreatitis, and differentiate the disease from pancreatic adenocarcinoma. Previous profiling studies have been hampered by similarities between the two diseases. We will use a completely novel approach doing large-scale miRNA microarrays on tissue as well as plasma samples from the same individuals, to rule out plasma miRNAs predominantly derived from other sources than pancreatic cells. Next, we hope to identify chronic pancreatitis specific serum markers and validate them in a large-scale analysis. Quantitative assessment of plasma miRNAs in patients with chronic pancreatitis has never been done before and the plasma-tissue miRNA level comparison is a novel approach not only in chronic pancreatitis but in the research of pancreatic cancer also, where interesting new miRNA profiles are expected to emerge. As pancreatic samples from patients are not readily available, the analysis of genetic alterations found in association with chronic pancreatitis provides the only useful pathological model of chronic pancreatitis in humans to date (account for less than 5% of CP cases); and the role of the exponentially growing field of epigenetics has hardly been tested in the pathophysiology of CP. The in silico and functional phase of the study will identify miRNA targets and describe for the first time that miRNAs are linked to the pathogenesis of chronic pancreatitis.
What is the significance of your research?:
The present proposal set out to contribute to the growing understanding of the role of microRNAs (miRNAs) in disease pathogenesis by describing the global expression patterns of miRNAs in chronic pancreatitis, a debilitating condition with chronic pain leading to diabetes mellitus and in some cases pancreatic adenocarcinoma. Developing a specific and sensitive blood-based miRNA biomarker assay is particularly relevant to chronic pancreatitis due to the current limitations in diagnostic methods, lack of early stage disease symptoms and because of the difficulty of sampling due to the retroperitoneal location of the pancreas. The application of the knowledge gained from these studies may be broad since expression patterns of specific miRNAs (1) can help in the early diagnosis of chronic pancreatitis, (2) can be used to predict prognosis and aid in proper biomarker-based staging, (3) can facilitate the accurate separation between pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma. These tests, if validated in a large-scale study, may be useful in the future as cheap, non-invasive screening test for chronic pancreatitis. The functional assays of the project will identify important miRNA regulated cellular mechanisms in chronic pancreatitis, with the promise of affecting intracellular processes by novel ways of treatment.
Final report
Results in Hungarian
Bevezetés: A krónikus pankreatitisz a hasnyálmirigy állományának fokozatos pusztulásával járó elhúzódó gyulladásos megbetegedés, amely emésztési zavarhoz, valamint a cukorháztartás felborulásához vezet. Az idült pankreatitisz fokozott rákrizikót is jelent, ezért a korai diagnózis és a ráktól való elkülönítés különös jelentőséggel bír. Jelen vizsgálatunkban olyan mikroRNS markerek azonosítását tűztük ki célul, amelyek segítik, hogy a hasnyálmirigy betegségben szenvedők pontos és korai diagnózishoz jussanak.
Eredmények: A statisztikai analízisek alapján egy 7 mikroRNS-ből álló mintázat a krónikus pankreatitiszt az egészséges szövetmintáktól nagy pontossággal különböztette meg (diagnosztikus pontosság 0.93, p=0.02, szenzitivitás 80%, specificitás 100%). A plazmaminták chip analízise során a krónikus pankreatitiszre „legspecifikusabb” 9 mikroRNS plazma-marker kiválasztása megtörtént. Az endoszkópia során gyűjtött kefecitológiai mintákban a kiválasztott markerek közül a miR-16 (p=0,0039), a miR-196a (p=0,0003) és a miR-221 (p=0,0049) relatív expressziója szignifikánsan magasabb volt a rosszindulatú mintákban, így biztonsággal különítették el a krónikus pankreatitiszt a daganatos mintáktól.
Konklúzió: A mikroRNS expressziós mintázat hasnyálmirigy betegségekben kórképre specifikus változásokat mutat szövet-, plazma- és kefecitológiai mintákban egyaránt, így alkalmas a gyulladásos minták pontos elkülönítésére az egészséges és daganatos szövetektől.
Results in English
Introduction: Chronic pancreatitis (CP) is a persistent inflammation of the pancreas resulting in a decline in exocrine and endocrine function. Patients are at increased risk for pancreatic cancer (PC), a disease well known for its poor prognosis. However, the early diagnosis of chronic pancreatitis and the separation from PC can be quite challenging. The aim of the present study was to highlight microRNAs (miRNAs) that can help in the diagnosis using plasma specimens (control/CP/PC) and tissue obtained during surgery or endoscopic brush cytology sampling.
Results: Statistical analyses demonstrated that a set of only 7 miRNAs could differentiate between controls and CP patients with an accuracy = 0.93, p-value = 0.02, specificity = 100% and sensitivity = 80%. Analyses of plasma samples resulted in 9 potential „chronic pancreatitis-specific” plasma markers for future analysis. In the endoscopically obtained samples relative expression of miR-16, miR-221 and miR-196a was significantly higher in cancer specimens (p=0.0039, p=0.0049 and p=0.0003, respectively), therefore discrimination between cancer and chronic pancreatitis was also possible. Conclusions: Expression patterns of miRNAs are significantly altered in pancreatic diseases. Microarray analyses identified statistically unique profiles which have the potential to separate between the different diseases using plasma, surgical tissue and endoscopic brush cytology samples.
Le N., Nagy Z., Burai M., Tarpay Á., Pozsár J., Pap Á., Molnár B., Tulassay Z., Bak M., Szmola R: Analysis of microRNA expression in brush cytology specimens as a new diagnostic tool in pancreatobiliary strictures, Z Gastroenterol 52, A37, 2014
N. Le, Z. Nagy, M. Burai, Á. Tarpay, J. Pozsár, Á. Pap, B. Molnár, Z. Tulassay, M. Bak, R. Szmola: Analysis of microRNA expression in brush cytology specimens as a new diagnostic tool in pancreatic strictures., Pancreatology 14, S129, 2014
Le N, Nagy Z, Szanyi S, Szűcs Á, Borka K, Molnar B, Tulassay Z, Szmola R: MicroRNA expression profiling signatures to separate chronic inflammation from pancreatic cancer., Z Gastroenterol 53, 9, 2015
