 |
Investigating the central role of Trip8b in hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-regulated channel function
|
Help 
Print 
|
Here you can view and search the projects funded by NKFI since 2004
Back »
|
| |
Details of project |
|
|
| Identifier |
104365 |
| Type |
PD |
| Principal investigator |
Fodor, Krisztián |
| Title in Hungarian |
A Trip8b központi szabályozó szerepének vizsgálata hiperpolarizáció-aktivált ciklikus nukleotid-f0ggő csatornák működésében |
| Title in English |
Investigating the central role of Trip8b in hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-regulated channel function |
| Keywords in Hungarian |
HCN csatorna, Trip8b, peroxiszomális receptor, szerkezeti biológia, fehérje kölcsönhatás |
| Keywords in English |
HCN channel, Trip8b, peroxisomal receptor, structure biology, protein interaction |
| Discipline |
| General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences) | 60 % | | Ortelius classification: Molecular biology | | Structural biology (crystallography and EM) (Council of Medical and Biological Sciences) | 30 % | | Molecular and cellular neuroscience (Council of Medical and Biological Sciences) | 10 % |
|
| Panel |
Molecular and Structural Biology and Biochemistry |
| Department or equivalent |
Department of Biochemistry (Eötvös Loránd University) |
| Starting date |
2012-09-01 |
| Closing date |
2014-08-31 |
| Funding (in million HUF) |
22.160 |
| FTE (full time equivalent) |
1.80 |
| state |
closed project |
Summary in Hungarian A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
A hiperpolarizáció-aktivált ciklikus nukleotid-függő (HCN) csatornák biztosítják a központi idegrendszer és a szív egyes sejtcsoportjainak ritmikus működését. Az agyban a HCN csatornákhoz a Trip8b szabályozó fehérje csatlakozik, amely mind a csatorna kapuzását (nyitás-csukódás), mind a sejtfelszínen való jelenlétét (expresszióját) képes modulálni. Alternatív splicing révén több, az N-terminálison eltérő hosszúságú Trip8b molekula található meg a sejtekben, amelyek közös tulajdonsága, hogy a csatorna nyitását gátolni képesek úgy, hogy elfoglalják a csatorna cAMP kötőhelyét. A különböző splice variánsok azonban eltérő hatással vannak a HCN csatornák felszíni expressziójára. A Trip8b molekulák a szabályozás központi szervezőjeként valószínűleg más fehérjékhez kötődve képesek többféle konformációt felvenni, és így tudják ellátni komplex szabályozó feladatukat. Hipotézisem szerint az agyban megtalálható Rab8b fehérje a Trip8b-ben kiváltott konformációváltozás révén képes megnövelni a csatornák felszíni jelenlétét, míg az expresszió csökkenése a Trip8b fehérje N-terminálisa és az adaptor protein-2 kölcsönhatásának eredménye. A Trip8b komplex szabályozó funkciójához elengedhetetlennek tűnik, hogy a molekula N- és C-terminális fele egymással kommunikáljon, akár nagyobb komplexek kialakulásán keresztül. Pályázatom célja, hogy biokémiai, biofizikai és szerkezeti biológiai módszerekkel megvizsgáljam, milyen molekuláris mechanizmusok biztosítják a Trip8b szabályozó szerepét. Ehhez a Trip8b kölcsönhatási hálózatának feltérképezése után néhány komplex quantitatív jellemzését, kristályosítását és szerkezetmegoldását fogom elvégezni.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
A Trip8b két kötőhelyen kapcsolódik az általa szabályozott HCN csatornákhoz, ahol a két kölcsönhatás egyben fizikailag is elkülöníti a HCN kapuzásának és expressziójának szabályozását. A felső kötőhelyet a HCN ciklikus nukleotid-kötő doménje és a Trip8b középső doménjének egy konzervált régiója alkotja, míg az alsó kötőhely a Trip8b TPR doménje és a HCN C-terminálisa között létesül. A felső interakciós helynek szerepe van a csatorna nyitás gátlásában, valamint, bizonyos splice variánsok esetén, a csatorna fehérjék számának csökkentésében is. Az alsó kölcsönhatás ezzel szemben, akár további fehérjék kapcsolódásán keresztül, mind a csatornaműködés növelésében, mind a csökkentésében szerepet játszhat, az adott splice variánstól függően. A HCN csatornák szabályozásával kapcsolatban egyre több funkcionális adat lát napvilágot, a folyamatban résztvevő komplexek felépítéséről azonban nagyon keveset tudunk. Pontosan mely fehérjék vesznek részt az expresszió növelésében és melyek a csökkentésében? Mi a szerepe az eddig nem tisztázott funkciójú Rab8b-nek azon túl, hogy kölcsönhatást létesít a Trip8b-vel? Hogyan kommunikál egymással a Trip8b molekula N- és C-terminális fele? Valóban egyetlen kötőhelyért verseng a cAMP és a Trip8b középső doménje? Milyen evolúciós kapcsolat van a Trip8b és a Pex5p között?
Alaphipotézisem szerint az aktivitásnöveléshez a megfelelő Trip8b splice variánsok Rab8b-közvetített konformációváltozása szükséges, amelynek eredménye egy endocitózis inkompetens HCN-Trip8b-Rab8b komplex, míg az aktivitáscsökkenés hátterében az endocitózis kompetens HCN-Trip8b-AP2 komplex létrejötte áll, amelynek kialakulása során a Rab8b kötés gátlódhat.
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
Az ioncsatornák működésének modulálásában gyakran szerepelnek olyan kiegészítő fehérjék, amelyek a csatorna központi pórusának kialakításában nem vesznek részt. Ilyen a Trip8b molekula is, amely a HCN csatornák membrán-expresszióját és nyitását szabályozza. A megpályázott kutatási program eredményei jelentősen hozzájárulhatnak a HCN csatornák működésének megértéséhez, és a meghatározandó molekulaszerkezetek racionális gyógyszertervezés alapjául szolgálhatnak. Mindezen túlmenően, érdekes alapkutatási kérdésekre is választ kaphatunk. A Trip8b molekula egy sikeres evolúciós találmány, ahol a jól ismert, fehérjeinterakciók platformjául szolgáló TPR domén csatlakozik egy másik doménhez, ahol további fehérjék versenyezhetnek speciális kötőhelyekért. Ez a felépítés nagyon hasonló a peroxiszomális import receptor Pex5p szerveződéséhez, ahol a TPR domén köti a peroxiszomális mátrixba tartó fehérjemolekulákat, az N-terminális pedig specifikus interakciókon keresztül az import lebonyolításában játszik szerepet, az import egyes lépéseinek megfelelő kölcsönhatásokat létrehozva. Mivel jelenleg nem ismert sem a Trip8b, sem a Pex5p teljes szerkezete, a Trip8b által létrehozott komplexek biofizikai és szerkezeti jellemzése nagyban hozzájárulhat ahhoz, hogy jobban megértsük az ilyen típusú fehérjék működését.
A megpályázott projektnek közvetlen hatása lehet az epilepszia kutatásra is. Korábbi vizsgálatok kimuttaták, hogy 28 nappal a status epilepticus kialakulása után jelentősen csökken a Trip8b:HCN1 kölcsönhatás. Ugyanekkor a HCN1 csatornák lokalizációja is megváltozik, aminek következményeként lecsökken a hiperpolarizációkor aktiválódó „furcsa” ionáram, Ih. A Trip8b TPR domén és a HCN csatornák C-terminálisa között kialakuló kölcsönhatás elengedhetetlen a megfelelő szabályozáshoz, és lehetséges, hogy az epilepszia kialakulásával járó valamilyen molekuláris esemény (pl. foszforiláció) gátolja a kötődést. A regulációban részt vevő komplexek szerkezetének ismerete nagyban segíthetné a további vizsgálatokat.
Összefoglalva, a pályázatban bemutatott kutatásnak nagy szerepe lehet abban, hogy jobban megértsük a HCN csatornák működését, és hozzájárulhat hibás szabályozási mechanizmusok molekuláris alapjainak megismeréséhez.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
Az állati sejteket biológiai membránok határolják, amelyek főként lipidekből és fehérjékből állnak. A membrán két oldalán található ionok koncentrációjának különbsége feszültséget, membránpotenciált generál, amelynek gyors megváltozása akciós potenciál kialakulásához vezet. Ennek fontos szerepe van az idegsejtek egymás közötti kommunikációjában vagy az izomsejtek összehúzódásában. Ingerelhető sejtekben a membránba beágyazódott fehérjék, feszültségfüggő ioncsatornák biztosítják az ionok vándorlását a membrán-potenciálnak megfelelően. A sejtmembrán hiperpolarizációjakor egy speciális csatorna-családba tartozó fehérjék, a hiperpolarizáció-aktivált ciklikus nukleotid-függő (HCN) csatornák aktiválódnak. Ezek számos élettani folyamatban vesznek részt, biztosítják például a szívműködés ritmusosságát, de szerepük van az alvásban, a tanulásban és az emlékezésben is. Emlősökben négy homológ fehérje tartozik ebbe a családba (HCN1-4), és a szabályozásuk központi eleme a Trip8b nevű fehérje, amely képes kölcsönhatást létesíteni mind a HCN csatornákkal, mind egyéb, a csatornák működéséhez fontos fehérjékkel. A Trip8b feladata, hogy hozzájáruljon a csatornák nyitásának és csukásának szabályozásához, illetve az éppen a membránban működő csatornák számát is képes befolyásolni. Pályázatomban a Trip8b által létrehozott kölcsönhatás-hálózatot szeretném vizsgálni biofizikai és szerkezeti biológiai módszerekkel. A különböző Trip8b-komplexek 3D szerkezetének meghatározása segíthet megérteni, hogy milyen molekuláris mechanizmusok biztosítják a HCN csatornák működésének szabályozását, valamint fényt deríthet egyes HCN csatornákhoz kötődő betegségek (pl. epilepszia) szerkezeti hátterére is.
| Summary Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels ensure the rhythmic activity of a group of cells in the heart and the central nervous system. In the brain they are associated with the auxiliary regulatory protein Trip8b, which is able to both modulate gating and alter channel surface expression. Trip8b undergoes alternative splicing at its N-terminus. While all splice forms inhibit channel opening by antagonizing cyclic nucleotide function, different splice variants produce diverse effects on HCN channel membrane trafficking. As a central organizer, Trip8b may recruit various protein partners following the needs of the cell. According to my working hypothesis, the brain-localized Rab8b can enhance upregulation by inducing a conformational change in the Trip8b structure, while downregulation can take place due to interaction between the N-terminal segment of Trip8b and adaptor protein-2 (AP-2). The elaborate way of Trip8b modulation presumes a communication between the two ends of the protein that may realize through the formation of oligomeric complexes. My proposal aims to use biochemical, biophysical and structure biology methods to unravel the molecular mechanisms of HCN regulation. Complex formation using various members of the Trip8b interactome in vitro, quantitative description of the complexes and determination of their 3D structures are the key steps of the project.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
Trip8b regulates HCN channel function by forming a bipartite interaction, where the two binding sites play distinct functional roles in HCN trafficking and gating. The upstream binding site is where the cyclic nucleotide-binding domain of HCN interacts with a conserved segment of Trip8b middle domain. This interaction seems to be necessary for the inhibition of channel opening, and to mediate the downregulation effect of a certain set of Trip8b isoforms. The downstream interaction site, where the Trip8b TPR domain binds the C-terminal signal peptide of the HCN channel may mediate the formation of regulatory complexes for both up- and downregulation of HCN surface expression. Although there are an accumulating number of functional data concerning the mechanisms of HCN modulation, our knowledge is limited regarding structural information on the protein complexes.
Which proteins do participate in complex formation during up- and downregulation? What is the role of Rab8b, a protein that has unknown function but does interact with Trip8b? How the necessary communication between the N- and C-terminal halves of Trip8b is ensured? Do the cAMP and Trip8b middle domain binding sites overlap? What is the evolutionary relationship between Trip8b and Pex5p?
To answer these questions I will test a hypothesis, where the upregulating Trip8b splice variants recruit Rab8b, undergo a conformational change, and thus create a non-endocytosis competent HCN-Trip8b-Rab8b complex. In contrast, downregulating variants form an endocytosis competent HCN-Trip8b-AP2 complex, where Rab8b binding may be inhibited.
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
Ion channel function and trafficking are often regulated by auxiliary proteins that do not contribute to the pore forming core of the channel. Recent studies have revealed that Trip8b is a central regulator of HCN channel gating and trafficking. Expected results from the proposed research will significantly improve our knowledge on HCN channel function, and the crystal structures of various Trip8b complexes may serve as a basis for rational drug design. Furthermore, molecular arrangement of Trip8b implies an evolutionary successful functional assembly, where a TPR domain, a well-known platform for protein interactions, is attached to a second domain where various binding partners may compete for specific binding sites. In this respect, Trip8b is very similar to the peroxisomal receptor Pex5p, of which TPR domain binds cargos destined to the peroxisomal matrix, whereas the N-terminal half contains several binding sites for the import peroxins, forming specific interactions in a timely manner. In the absence of any structural information on the complexes or the full-length proteins Trip8b or Pex5p, quantification of binding affinities within different Trip8b complexes as well as determination of new 3D structures will advance our understanding of the function of such regulatory/receptor proteins.
Epilepsy is a chronic disorder of neuronal processes crucial for homeostasis of excitability. Previous studies showed that 28 days after status epilepticus the interaction between Trip8b and HCN1 is significantly reduced. At the same time point, mislocalization of HCN1 can be observed, and, as a consequence, down-reagulation of the funny current Ih. Trip8b TPR interaction with the C-terminus of HCN channels is substantial, and changes in the molecular environment (e. g. phosphorylation) initiated by epileptogenesis may block this interaction. Availability of structural information on the functional complexes that play a key role HCN modulation is of high importance for further investigations.
In conclusion, the proposed project will have high impact on the general understanding of the function and regulation of ion channels, and may help to discover molecular mechanisms that lead malfunctioning channel regulation.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
All animal cells are separated from their environment by a biological plasma membrane composed of mainly lipids and proteins. On opposite sides of the membrane a difference in the concentration of ions results in a voltage called membrane potential. A rapid change in the membrane potential can lead to an action potential, which is important in neuronal cell-to-cell communication or initiating contraction in muscle cells. In excitable cells transmembrane proteins called voltage-gated ion channels ensure the flow of ions down their electrochemical gradient, in response to membrane potential. Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-regulated (HCN) channels are activated when the membrane is hyperpolarized, and have a prominent role in generating the rhythmicity of the heartbeat and in processes such as sleep, learning and memory. In mammals the HCN channel family comprises four homologous members (HCN1-4), and recent studies have shown that the central regulator of HCN channel function is Trip8b, a protein that is able to form specific interactions with both HCN channels and other proteins, according to the needs of the cells. Trip8b has a prominent role in the opening and closing of the channel, and is also important in modulating the number of channels that are available in the membrane. My proposal aims to study the interaction network created by Trip8b, using biophysical and structure biology techniques. With the generation of 3D images of various Trip8b complexes, we will be able to better understand the molecular mechanisms of HCN channel regulation as well as the structural background of various HCN-related diseases, such as epilepsy.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
