Fehérjeszenzorok és antibakteriális peptidek irányított evolúciója mikrofluidikai cseppekben
Title in English
Directed Evolution of Protein Sensors and Antibacterial Peptides in Microfluidic Droplet Compartments
Keywords in Hungarian
irányított evolúció, in vitro kompartmentalizáció, mikrofluidika, allosztérikus aktiváció, antimikrobiális peptidek
Keywords in English
directed evolution, in vitro compartmentalisation, microfluidics, allosteric activation, antimicrobial peptides
Discipline
Analysis, modelling and simulation of biological systems (Council of Medical and Biological Sciences)
50 %
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)
30 %
Ortelius classification: Enzimology
Microbiology: virology, bacteriology, parasitology, mycology (Council of Medical and Biological Sciences)
20 %
Panel
Genetics, Genomics, Bioinformatics and Systems Biology
Department or equivalent
Institute of Biochemistry (HUN-REN Biological Research Centre Szeged)
Starting date
2012-12-01
Closing date
2015-11-30
Funding (in million HUF)
23.694
FTE (full time equivalent)
2.43
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. Fehérjék irányított evolúciós optimalizálása során hatalmas génkönyvtárakból választjuk ki a kívánt feladatra legrátermettebb variánsokat. A módszer limitáltan alkalmazható enzimekre és biológiai reakciókra, mert a jelenlegi hatásszűrő technologiák alacsony áteresztőképessége gyakran az evolúciós folyamat sikertelenségéhez vezet. A problémára megoldást jelenthet egy új miniatürizációs technika (mikrocsepp technológia), melyet enzimek hatékonyságnövelésére alkalmaztunk a közelmúltban. Az eljárás során a reakciók parányi, pikoliter térfogatú vízcseppekben zajlanak, és a reakció által generált fluoreszcens jel alapján másodpercenként 1000 csepp kvantitatív analízisét tudjuk elvégezni. Jelen pályázat keretében a kifejlesztett hatásszűrési rendszert szeretnénk továbbgondolni és felhasználni a következő célokkal: 1. Hidrolitikus enzimek aktivitását szabályozó allosztérikus kötőhelyek beépítése, hogy enzimekből mesterséges szenzorokat hozzunk létre a kívánt ligand jelenlétének érzékelésére. 2. Nagy áteresztőképességű sejt-toxicitást szűrő rendszer kidolgozása, hogy javíthassuk antimikrobiális peptidek baktériumsejt pusztitó hatását.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. A probléma, amire igyekszünk megoldást találni, hogy hogyan vonhatóak be újabb biológiai reakciók azon funkciók körébe, amelyek irányított evolúcióval fejleszthetőek. A kívánt tulajdonságú enzimek evolúciós kiválasztásához ugyanis az is szükséges, hogy a kérdéses funkció szelektálható vagy mérhető legyen, lehetőleg egy olyan módszerrel, amely megengedi a nagy áteresztőképességet. A mikrocsepp technika az első olyan nagy áterersztőképességgel bíró módszer, ahol az egyetlen kritérium a reakció alkalmazhatóságára a reakció által generál fluoreszcens jel megléte. Ugyanakkor ez a feltétel is nagyon kevés biológiai reakció esetben teljesül. Ezért rendkívül fontos a hatásszűrési alapelvek kiterjesztése, hogy minnél több biológiai funkció legyen mérhető a cseppek által biztosított reakciótérben, és így alkalmas irányított evolúcióra. Jelen pályázat keretében olyan fluoreszcens szenzorokat szeretnénk kifejleszteni, amelyek képesek más enzimreakcók termékeit érzékelni, és így lehetővé válik ezen enzimek irányított evolúciója a mikrocsepp technológiával. A második alprojekt során pedig egy olyan módszert fejlesztünk, ahol a baktérium sejt megölése és lízise alakul át egy fluoreszcens jellé, így képesek leszünk a sejt-toxicitásra is szelektálni.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! Jelen pályázat jelentősége három külön kérdéskör mentén fogalmazható meg.
1. A mikrocsepp technika területe rohamos iramban fejlődik, és az utóbbi években megjelenő tanulmányok azt mutatják, hogy hatalmas potenciállal rendelkezik az irányitott evolúció számára. Jelen pályázatban két olyan biológiai funkcióra szeretnénk kiterjeszteni a technika alkalmazhatóságát (allosztérikus regulációra és sejt-toxicitás), amelyek kvantitatív analízise korábban nem volt elérhető nagy áteresztőképességű hatásszűrő rendszerben, és így hatékony irányított evolúciójuk sem volt kivitelezhető. Reményeink szerint a pályázat így hozzájárul a mikrocsepp technológia fejlődéséhez is.
2. Alloszrerikus szabályozás fehérjékbe történő beépítésével olyan kapcsoló molekulákat kapunk amelyek ki és bekapcsolhatóak egy kívánt külső jel hatására. Számos alkalmazásuk elképzelhető, gondojunk csak mesterséges génhálózatokra, vagy olyan bioszenzorokra, amelyek képesek egy anyag jelenlétét kimutatni. Mi olyan fluoreszcens szenzorokat szeretnénk kifejleszteni, amelyek iparilag fontos enzimek reakciótermékeit érzékelik, így azok az irányított evolúció által optimalizálhatóvá válnak. A képesség, hogy enzimeket tudjunk átszabni biotechnológiai alkalmazásokhoz, a fenntartható európai vegyipar egyik fontos pillérének tekinthető az enzimek környezetre gyakorolt alacsony hatása következtében.
3. A jelenleg forgalomban lévő antibiotikumok ellen egyre rezisztensebb baktériumtörzsek jelennek meg. Ennek komoly népegészségügyi következményei lesznek, ha belátható időn belül nem fejlesztünk ki új terápiás eljárásokat. A számos klinikai vizsgálatokban lévő antimikrobiális peptid azt mutatja, hogy ezek a molekulák kiemelt jelentőséggel bírhatnak ebben a küzdelemben. Előnyük a klasszikus gyógyszermolekulákkal szemben, hogy irányított evolúcióval lehetséges hatékonyságuk növelése. Jelen pályázat jelentősége, hogy a mikrocsepp technológia olyan átersztőképességet biztosíthat toxikus peptidek hatásszűréséhez, mely a jelenleg használatos rendszerekkel kivitelezhetetlen.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. A gyümölcsfákhoz hasonlóan a fehérjék tulajdonságai is javíthatóak nemesítéssel, úgynevezett irányított evolúciós folyamattal, amíg a kívánt minőséget el nem érjük. A nemesítés során a fehérjéken apró változatatásokat hozunk létre, és minden egyes fehérje variáns aktivitásának tesztelésével kiválasztjuk azokat, amelyek a feladatot hatékonyabban végzik. Az egyik kritikus faktor a folyamat során, hogy hány fehérje változat tesztelésére van kapacitásunk. Ezért egy olyan miniaturizációs technológiát fejlesztettünk ki a Cambridge-i Egyetemen, amely segítségével több millió tesztreakció egyidejű futtatása lehetséges, a hagyományos rendszerekhez képest tízezerszer kissebb térfogatban. Legfrissebb eredményeink bizonyítják, hogy a fejlesztéssel ezerszeresére növeltük az egységnyi idő alatt vizsgálható fehérjeváltozatok mennyiségét, és így az evolúciós folyamat sikerének valószínűségét. Jelen pályázat keretében szeretnénk a cambridge-i technológiát hazahozni, és a molekuláris nemesítési folyamatot két fontos területen alkalmazni. Szeretnénk fehérjeszenzorokat fejleszteni, amelyek tetszőleges molekulák érzékelésére képesek. Elméletünk szerint az új technikával több millió fehérjeszenzor érzékenységét analizálhatjuk, és így kiválaszthatjuk azokat, amelyek érzékenyebbek a kimutatandó anyag jelenlétére. Ezen túlmenően szeretnénk a rendszert hatékonyabb antibakteriális fehérjék fejlesztésére is beállítani, hiszen ezek a molekulák új lehetőséget jelentenek az ellenálló baktériumtörzsekkel szembeni harcban. Ennek kiemelt jelentősége van, hiszen napjainkaban egyre kisebb az esély számos bakteriális fertőzés gyógyítására hagyományos antibiotikumos kezeléssekkel.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. During the directed evolution of biological molecules the fittest variants are selected from sizable gene libraries. The procedure is partially applicable for the evolution of enzymes and biological reactions, since the restricted throughput capacities of currently used screening technologies frequently result in unsuccessful experiments. To address this issue a new miniaturization methodology is emerging (microdroplet technology) that we have recently applied for the screening of biological reactions in our directed evolution experiments. The reactions are carried out in monodisperse aqueous droplets with picoliter volumes that we can analyse quantitatively at a rate of 1,000 droplets per second, using the fluorescence signal generated by the enzyme reaction. In the frames of the current proposal we would like to develop further this screening technology with the following aims: 1. The construction of allosteric regulatory sites into hydrolitic enzymes so that we can create artificial biosensors for sensing an arbitrary ligand. 2. The establishment of a high throughput cyto-toxicity screening procedure in order to improve the effectiveness of antimicrobial peptides’ killing activity.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. The problem we are proposing to tackle is how to involve new biological reactions into the circle of functions that can be developed by directed evolution. In order to find the fittest variants it is necessary that the function has a selectable or measureable trait. The microdroplet technology is the first high throughput methodology for the screening of enzyme libraries where the only requirement is the presence of a fluorescent signal generated by the enzyme reaction. However, the number of different reactions that are easy to optically assay with fluorescent substrates is surprisingly limited. Therefore, it is essential to expand the screening principles in order to make more biological functions measurable in microdroplets and therefore available for directed evolution. Here we propose the development of protein sensors that are capable of sensing the products of other enzyme reactions and convert this information to a fluorescent signal. The second project sets out the development of a cyto-toxicity based screening methodology where the killing and lysis of the bacterial cells is the signal that is transformed into a fluorescent.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. The relevance of the proposal can be defined along the lines of the following three topics:
1. The field of microdroplet technology is expanding at an enormous rate and recent studies show that it has considerable potential for directed evolution. This proposal aims to widen the applicability of this technology by including two new biological functions (allosteric regulation and cyto-toxicity), the quantitative analysis of which was previously not available in high throughput screening format and therefore their efficient directed evolution was not possible.
2. By introducing allosteric regulation into enzymes we construct protein switches that can be turned on and off by an arbitary signal. Several applications can be imagined, such as artificial gene networks or biosensors that are able to detect the presence of a specific compound. We would like to develop fluorescent sensors in order to detect the reaction products of industrially important enzymes and therefore enable their optimization through directed evolution. The ability to tailor enzymes for biotechnological applications is one of the central pillars of sustainable European chemistry, due to the reduced environmental impact of ‘green’ biocatalytic processes compared to current hazardous chemical procedures.
3. The emergence of bacterial resistance to current antibiotics is going to result in serious health hazard if new therapeutic strategies will not be developed in the foreseeable future. The multitude of antimicrobial peptides being in clinical trials shows that these molecules might play an important role in addressing this situation. The advantage of these molecules over traditional small molecular drugs is that their effectiveness can be increased with directed evolution. The relevance of this proposal is that the microdroplet technology will provide such a throughput for the screening of cyto-toxicity effects that is unavailable with the current screening methodologies.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. Like fruit trees, proteins can also be improved with selective breeding, a selection practice to encourage chosen qualities. During this procedure, called directed evolution small changes are introduced into the proteins, and by testing the acitvity of each variant, those that perform the specific job better can be selected. One of the critical factors of the process is the number of protein variants we have the capacity to run through the test so as to be the most successful in finding the fittest variants. Therefore, we have developed a miniaturization technology at the University of Cambridge that enables the running of millions of test reactions simultaneously at a tenthousand times smaller volume than it was previously possible using traditional systems. Our latest results prove that this development has increased the amount of testable variants in a given time one thousand times and therefore the probability of success has also increased accordingly. With this grant application we are proposing to bring the Cambridge technology to Hungary for use in two important fields of molecular engineering. We would like to develop protein sensors that are capable of sensing specific molecules. With this new technology we could analyze the sensitivity of millions of protein sensors and select the most sensitive ones. We would also like to calibrate the system for the development of more effective antibacterial proteins as this could provide new promising opportunities in the fight against resistant bacteria. This is especially important as the chances of curing bacterial infections with traditional antibiotic treatment are rapidly decreasing.
Final report
Results in Hungarian
A pályázat keretében létrehoztuk a nagyáteresztő képességgel bíró hatásszűrési rendszer infrastruktúráját: beállítottunk egy sejtszorter készüléket (BD FACS Jazz), amely alkalmas víz-olaj cseppek válogatására, és lehetővé tettük az intézet számára a készülék használatát. Publikáltuk az előző laborommal (University of Cambridge), hogy hogyan alkalmazható a készülék irányított evolúciós alkalmazásoknál cseppek szortírozására (Analytical Chemistry, 2014). Egy genomskálájú hatásszűrést alkalmazva, ahol érzékeltük gyenge látens enzimaktivitások jelenlétét, feltérképeztük azokat az evolúciós kezdőpontokat az Escherichia coli bakterium metabolikus hálózatában, melyek metabolikus innovációra alkalmasak. A kísérleteket felhasználtuk a bakterium felszín alatti anyagcserehálózát leíró in silico modell igazolására. Hipotézisünk szerint a módszerrel képesek vagyunk előre jelezni azokat a metabolikus innovációkat, melyek az adaptációt tesznek lehetővé a bakterium számára (PNAS, 2014). Ennek alátámasztására az irányított evolúciós kísérletek jelenleg is folynak. Publikáltunk egy fejlesztést, amivel gyenge enzimaktivitásokat lehet kimutatni metagenomikai könyvtárakban víz-olaj cseppek felhasználásával (Nat Commun, 2015). Ezen túlmenően vállaltuk a munkatervben antimikrobiális peptidek irányított evolúcióját. Az ehhez szükséges esszéket kidolgoztuk, és a hatásszűrési kísérletek jelenleg is zajlanak, melyeket előreláthatóan a 2016-os év első felében lezárunk.
Results in English
In the proposed project we have established the infrastructure for high throughput screening, the setup of a cell sorter instrument (BD FACS Jazz), which is suitable to sort water-in-oil droplets and is now available for the use of the whole Institute. With my previous lab (University of Cambridge) we have also prepared the manuscript on how to apply the droplet sorting methodology for directed evolution with such an instruments (Analytical Chemistry 2014). Using a genome-wide screen we sensed systematically those weak promiscuous enzyme activities in the metabolic network of Escherichia coli that are suitable for metabolic innovation. The results were used to validate a computational model that describes the underground metabolic network of the organism. Our hypothesis is that we can predict metabolic innovations that form the basis of evolutionary adaption to new environments (PNAS, 2014). The directed evolution experiments that prove this hypothesis are under development. Recently we have published the detection of weak promiscuous enzyme activities from metagenomic libraries with the water-in-oil droplet screening methodology (Nat Commun., 2015). For the second part of the proposal, where the technology is applied to evolve antimicrobial peptides we have set up the assays and the directed evolution screens are carried out currently. Foreseeable, the experimental part will be finished in the beginning of 2016.
Richard A. Notebaart, Balázs Szappanos, Bálint Kintses, Ferenc Pál, Ádám Györkei, Balázs Bogos, Viktória Lázár, Réka Spohn, Bálint Csörgo, Allon Wagner, Eytan Ruppin, Csaba Pál, Balázs Papp: Network-level architecture and the evolutionary potential of underground metabolism, http://www.pnas.org/content/111/32/11762.full.pdf+html, 2014
Richard A. Notebaart, Balázs Szappanos, Bálint Kintses, Ferenc Pál, Ádám Györkei, Balázs Bogos, Viktória Lázár, Réka Spohn, Bálint Csörgo, Allon Wagner, Eytan Ruppin, Csaba Pál, Balázs Papp: Network-level architecture and the evolutionary potential of underground metabolism, http://www.pnas.org/content/111/32/11762.full.pdf+html, 2014
