A RISC komplexben lévő virális siRNS-ek és endogén kis RNS-ek analízise vírusfertőzés során
Title in English
RISC bound small RNAs: The small RNAs that matter during virus infection
Keywords in Hungarian
RISC, virális siRNA, miRNS, vírus, gazdanövény
Keywords in English
RISC, viral siRNA, miRNA, virus, plant
Discipline
Microbiology: virology, bacteriology, parasitology, mycology (Council of Medical and Biological Sciences)
100 %
Panel
Immunity, Cancer and Microbiology
Department or equivalent
Department of Dermatology and Allergology (University of Szeged)
Participants
Kénesi, Erzsébet Nagy, István
Starting date
2013-04-01
Closing date
2017-03-31
Funding (in million HUF)
37.431
FTE (full time equivalent)
4.55
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. Parelell szekvanálási eljárások segítségével jellemezték a kis RNS-ek képződését különböző genom organizációjú vírusok esetében. Az eredmények azt mutatták, hogy a fertőzött sejtekben hatalmas mennyiségű kis RNS képződött és a kis RNS-ek nem egyenletesen képződtek a virális genomról. Az erős másodlagos szerkezettel rendelkező régiókról nagy mennyiségben, míg más régiókról jóval kevesebb kis RNS képződik. Azonban az RNS silencing az RNS silencing szupresszorral nem rendelkező vírusok működését hatékonyan képes gátolni. E tények miatt nem rendelkezünk semmilyen adattak arról, hogy milyen virális kis RNS-ek képesek a RISC komplexekbe beépülni é ezáltal a vírusfertőzést megakadályozni. Az együttműködés lehetőséget biztosít arra, hogy mindkét kollaboráló partner erősségeit egyesítve megvalósítsuk a projekt célkitűzéseit.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. A virális siRNS-ek funkciójának megértésére a következő kérdéseket válaszoljuk meg: A vírusfertőzés során keletkező hatalmas kis RNS „pool”-ból melyek azok a kis RNS-ek, amelyek a RISC komplexbe beépülnek? Milyen arányban épülnek be a RISC komplexbe az erős másodlagos szerkezetű régiókról képződött virális siRNS-ek? Összevethető-e az arányuk a teljes vírusfertőzött szövetből származó eredményekkel? Vírusfertőzött szövetekben bizonyos vírusok esetében a pozitív szálról nagyobb mennyiségben keletkeznek kis RNS-ek. Vajon ilyen vírusok esetében nagyobb szában épülnek-e be RISC komplexbe a pozitív szálról képződő kis RNS-ek? A RISC komplex katalítikus alegysége az Argonaute (AGO) fehérje. Az endogén kis RNS-ek az AGO fehérjén keresztül szabályozzák a növény fejlődési programját. Vírusfertőzés során a hatalmas mennyiségű kis RNS milyen arányban épül be a de novo keletkező RISC komplexekbe és így megzavarhatja-e a növény fejlődési programját? Okozhatják-e a virális kis RNS-ek a tüneteket?
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! Az SPMMV RNS silencing szupresszor képes a virális si- és az endogén kis RNS-eket tartalmazó RISC komplexek gátlására. Munkánk során kihasználva a P1 fehérje egyedi jellegzetességet, szeretnénk izolálni és paralell szekvenálással meghatározni a vírusfertőzés során a RISC komplexekbe beépült kis RNS-eket. Ezzel a megközelítéssel számtalan, eddig még fel nem tett kérdésre kaphatunk választ. Meg tudjuk mondani, hogy a virális genom mely részéről képződött kis RNS-ek épülnek be a RISC komplexbe. Meg tudjuk állapítani, hogy a különböző szálaránnyal replikálódó vírusok (a pozitív szál nagyobb mennyiségben van jelen) esetében a RISC-be beépült virális kis RNS-ek melyik szálró származnak. És végül, meg tudjuk határozni azt, hogy az aktív RISC komplexek milyen arányban tartalmazzák a virális és az endogén kis RNS-eket. Ez egy nagyon fontos kérdés, ugyanis a elképzelésünk szerint az endogén kis RNS-t tartalmazóRISC komplexek arányának csökkenése is vezethet a tünetek kialakulásához. A magyar partner úttörő szerepet játszik a RISC komplexet gátló RNS silencing szuppresszorok kutatásában, míg a spanyol fél a parelell szekvenálást aktívan használó nemzetközileg elismert növényi virológus. Mindezek mellett a kutatás lehetőséget biztosít egy poszt-doktor tréningjére is.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. Az RNS silencing -majdnem az összes eukariótában megtalálható- celluláris mechanizmus, ami főként negatívan szabályozza a génexpressziót. Rendkívűl szerteágazó funkciói vannak, ide tartozik az antivirális funkció is. A növényi vírusok hatékonyan indukálják az RNS silencing-et, ezért a vírusokban ún. RNS silencing szupresszor fehérjék jelentek meg az RNS silencing semlegesítésére. Mivel a vírusfertőzés során hatalmas mennyiségben keletkeznek virális kis RNS-ek (az RNS silencing központi molekulái), azonban a virális kis RNS-ek-ről szinte alig rendelkezünk funkcionális adatokkal. Munkánk során célül tüztük ki a virális kis RNS-ek funkcionális vizsgálatát. Összefoglalva, különböző genomszerveződésű vírusokat tanulmányova az általunk kifejlesztett technikákkal, valamint nagy áteresztő képességű szekvenálási technológia felhasunálásával közelebb kerülhetünk a vírus gazda kapcsolat jobb megértéséhez.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. High throughput massive parallel sequencing approach was used to determine the small RNA profile of plant viruses infecting different hosts having different genome organizations. Analysis of several hundreds of thousands of reads showed that viral small RNAs of different sizes covered almost the whole genome of the viruses with different densities. Some regions were poorly represented however other regions, mostly foldback regions, were very highly represented in the small RNA population. In the case of certain viruses reads showed asymmetric distribution, while in the case of potyviruses the distribution was more symmetric. These results indicate that the whole viral genome is accessible for the plant DICER enzymes and foldback structures having basepaired nature are more preferred. Of note that most of the studied viruses have silencing suppressors that bind small RNAs and this kind of mechanism does not allow viral siRNAs incorporate into RISC complexes. However, RNA silencing is an effective antiviral mechanism, because viruses having no silencing suppressors, or bearing unfunctional mutant silencing suppressors are cleared from the host. Having known that a great amount of siRNA with different representation from different viral RNA structures are produced during virus infection, the functionality of the viral siRNAs is still largely unknown. The international collaboration will allow us to integrate the strenght of both partners to achieve the aims of the proposal.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. We intend to know what viral siRNAs are able to incorporate into RISC complexes? Is the representation of the RISC bound vsRNAs same as the vsRNAs from the virus infected tissue? In other words, in RISC complexes the vsRNAs processed from foldback structures are represented higher than vsRNAs form other genomic regions? Previous studies showed that in the case of nonrelated viruses the ratio of the vsRNA derived from the plus and minus strands correlates with the ratio of the plus and minus strands of the infected tissue. We would like to study if the same ratio is predominant is RISC bound vsRNAs? During virus infection a huge amount of vsRNA is produced. We will determine what fraction of RISC complexes will contain vsRNAs and endogenous (plant) small RNAs. Moreover, we would like to know how the representation of different plant small RNA species works out. Our hypothesis is that viral symptoms can be caused by either the drop of the concentration of RISC complexes containing endogenous small RNAs, or the change of representation of certain endogenous small RNA species in RISC complexes in virus infected cells. Both scenarios might disturb the developmental program of the plant leading to symptoms.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. Previous studies approached the analysis of the processed small RNAs during virus infection. In contrast, we are interested in the analysis of the RISC bound small RNAs during virus infection. SPMMV P1 protein inhibits small RNA bound RISC complexes in vivo. Using this unique nature of P1 silencing suppressor, we will develop a large-scale method to isolate RISC bound small RNAs. Moreover, taking advantage of the massive parallel sequencing, we will be able to get a great number of reads, which is sufficient for statistical analysis. Thus, we will learn what viral siRNAs are able to incorporate into RISC complexes from the huge pool of siRNAs that arose during virus infection. Having known the vsRNAs, we will determine the position of the RISC targeted regions on the viral genomic RNA. Thus, we will define if siRNAs derived from strong secondary structures or rather single stranded region are preferred by RISC during RISC assembly. This is a very important question, because no earlier study aimed to determine the potentially active vsRNAs during virus infection. Moreover, we will be able to establish the degree of RISC complexes containing vsRNAs or endogenous small RNAs. Furthermore, determining the degree of RISC complexes containing vsRNAs or endogenous small RNAs in a time course experiment will tell us if the vsRNAs or the endogenous small RNAs are preferred by the de novo RISC complexes during the progress of viral infection. In summary, studying unrelated viruses with different genome organization, using breakthrough techniques and technologies will provide important results to better understand host-virus interactions. The Hungarian partner has done a pioneering work on silencing suppressors inhibiting active RISC, while the Spanish partner is an internationally recognized plant virologist routinely using parallel sequencing. Finally, the proposal allows a high quality trainning of a post-doctoral fellow.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. RNA silencing is a post-transcriptional gene regulation mechanism conserved in almost all eukaryotes and involved in many essential biological processes including antiviral defense. Plant viruses efficiently induce RNAs silencing and RNA silencing hampers virus accumulation in infected plants, thus viruses evolved RNA silencing suppressors to counteract with the defence mechanism of the host. Although high throughput massive parallel sequencing approach was used to determine the small RNA profile of plant viruses infecting different hosts having different genome organizations, but the functionality of the viral siRNAs is still largely unknown. We aim to study the functionality of the viral siRNAs, thus we will learn what viral siRNAs are able to incorporate into RISC complexes from the huge pool of siRNAs that arose during virus infection. Taken tohether, studying unrelated viruses with different genome organization, using breakthrough techniques and technologies will provide important results to better understand host-virus interactions.
Final report
Results in Hungarian
Munkánk során megkíséreltük az AGO kötő tulajdonsággal rendelkező P1 virális fehérje segítségével a vírusfertőzés során az AGO komplexekbe beépült kis RNS populáció vizsgálatát. Eredményeink szerint a P1 köti az antivirális silencingben szerepet játszó AGO1 és AGO2 fehérjéket egyaránt. Különböző modellrendszerekben és különböző megközelítéseket alkalmazva megállapítottuk, hogy a virális P1 fehérjével végzett AGO/kis RNS komplexek izolálásának hatékonysága sokkal alacsonyabb volt, mint vártuk.
Megállapítottuk, hogy a transzlációs gátlásban kulcsszerepet játszó AMP1 fehérje WG/GW motívumokkal rendelkezik és a harmadik WG/GW motívum vesz részt az AGO proteinnel való kapcsolat kialakításában. Továbbá megállapítottuk, hogy az AMP1 gátolja az AGO1 target RNS vágó aktivitását in vitro és in vivo is. Eredményeink az AGO1 fehérje új típusú regulációját mutatják be.
Results in English
During the course of our work, we aimed to characterize the small RNA populations loaded into RISC complexes upon virus infection. The use of P1 protein for this purpose was based on that it binds AGO1 proteins loaded with both mi- and viral derived siRNAs. Exploiting different models and approaches, the use of P1 as a bait to isolate small RNAs incorporated into AGO proteins was not efficient enough to draw solid conclusions.
Moreover, we present the evidence that the AMP1 protein involved in the miRNA driven translational inhibition is a WG/GW protein. In a reconstituted in vitro system using purified AGO1 and AMP1 proteins we found that the AMP1 protein inhibits target cleavage activity of AGO1. Then, the association of AGO1-AMP1 complex with the AGO2 mRNA indicated that AMP1 dependent inhibition of AGO1 target cleavage activity occurs in vivo as well. Therefore, our finding represents a novel layer in the regulation of AGO activity in plants.
Edit Zsuzsanna Szabó1, Lajos Kemény1,2, Lóránt Lakatos1,2: Deletion series of the P1 protein of the Sweet potato mild mottle virus identifies the shortest fully functional RNA silencing suppressor domain, http://www2.sci.u-szeged.hu/ABS/2014/Acta%20HPb/58163.pdf, 2014
