Physiological role and regulation of Rac GTPase activating proteins in neutrophilic granulocytes  Page description

Help  Print 
Back »
 

Details of project

  
Identifier
108382
Type K
Principal investigator Ligeti, Erzsébet
Title in Hungarian Neutrofil granulocitákban kifejeződő Rac GTPáz aktiváló fehérjék élettani szerepe és szabályozása
Title in English Physiological role and regulation of Rac GTPase activating proteins in neutrophilic granulocytes
Keywords in Hungarian neutrofil granulocyta, fagocitózis, NADPH oxidáz, GTPáz aktiváló fehérje
Keywords in English neutrophilic granulocytes, phagocytosis, NADPH oxidase, GTPase activating protein
Discipline
Cell differentiation, physiology and dynamics (Council of Medical and Biological Sciences)100 %
Panel Physiology, Pathophysiology, Pharmacology and Endocrinology
Department or equivalent Dept. of Physiology (Semmelweis University)
Participants Bartos, Balázs Ádám
Csépányi-Kömi, Roland
Czárán, Domonkos Tamás
Lőrincz, Márton Ákos
Timár, Csaba István
Wisniewski, Éva
Starting date 2014-01-01
Closing date 2018-12-31
Funding (in million HUF) 39.571
FTE (full time equivalent) 15.06
state closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
A kutatási téma fő célja a munkacsoport által a közelmúltban klónozott új fehérje, az ARHGAP25, egy Rac GTPáz aktiváló fehérje (RacGAP) specifikus élettani szerepének vizsgálata neutrofil granulocitákban (PMN). A kutatás lényeges új információt nyújt a különböző RacGAP-ok aktivitását szabályozó mechanizmusokról, és az azonos sejtben kifejeződő számos RacGAP specifikus vagy átfedő funkciójáról is. A kísérleteket emberi vérből ill. egér csontvelőből izolált PMN-en, model sejtvonalakon, sejtmentes rendszerben, tisztított fehérjéken és genetikailag módosított állatokon (ARHGAP25-deficiens egerek) végezzük. Izolált PMN-ben megvizsgáljuk az ARHGAP25 kapcsolódását a fagoszómához, a fehérje foszforilációs mintázatát, keressük a RacGAP-ok együttműködő partnereit és vizsgáljuk a GAP-ok expressziós szintű szabályozását. Model sejtvonalakat alkalmazunk az ARHGAP25-nek a fagoszómához való kapcsolódásában lényeges molekula-szakaszok felderítésére, valamint a mutáns RacGAP-ok kifejezését követő funkcionális változások meghatározására. A NADPH oxidáz működését befolyásoló RacGAP-okat sejtmentes rendszerben fogjuk azonosítani. A fehérje-lipid kölcsönhatásokat, valamint a foszforiláció hatását a GAP aktivitásra izolált fehérjéken vizsgáljuk. Vad-típusú és ARHGAP25-deficiens egerek csontvelőjéből izolált PMN-en összehasonlítjuk a különböző ingerekre bekövetkező szuperoxid termelést, fagocitózist, baktériumölést és sejtvándorlást. Az eredmények függvényében alkalmazunk további állatmodelleket az ARHGAP25 patológiás szerepének felderítésére.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
A kis G fehérjék Rho/Rac családjában a szabályozó GTPáz aktiváló fehérjék (GAP-ok) száma 3-4-szer haladja meg a családhoz tartozó kis G-fehérjék számát. Jelenleg alig van adat arról, hogy a humán genomban megtalálható mintegy 70 Rho/RacGAP specifikus vagy redundáns funkcióval rendelkezik-e. Ezen kutatási terv célja a probléma részletes vizsgálata neutrofil granulocitákban. Alapkérdésünk, hogy az általunk a közelmúltban klónozott ARHGAP25 – és esetleg más, korábban felfedezett Rac/RhoGAP-ok is – nagy molekula-komplexekbe ágyazva helyezkednek-e el, ahol más fehérjékkel valamint lipidekkel való együttműködésük a részvételüket specifikus jelpályákra korlátozza. A kutatási periódus végére legalább a neutrofil granulocitákban jelenleg ismert 4 Rho/RacGAP-ról (ARHGAP25, p50GAP, p190GAP, Bcr) rendelkezünk részletes adatokkal, és jellemezni tudjuk majd a különböző fagocita funkciókban való részvételüket.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
A neutrofil granulociták központi szerepet játszanak a természetes immunitásban, mivel gyorsan képesek a fertőzés helyszínére vándorolni és ott a kórokozó mikroorganizmust bekebelezni és lebontani. A neutrofilok működésének pontos szabályozása elengedhetetlen. Mind túlzott, mind elégtelen működésük súlyos, időnként végzetes megbetegedéshez vezet. Kis G-fehérjék minden sejtműködés szabályozásában részt vesznek. A kis G-fehérjék tömege 20 kD körüli, szerkezetük erősen konzervált, és csak nagyon kevés direkt módosítás történik rajtuk. Ezzel szemben szabályozó fehérjéik (GEF-ek, GAP-ok, GDI-k) nagy, sok doménből álló fehérjék, amelyek számos molekuláris interakcióban vesznek részt, és kovalens módosításra alkalmas csoportokat tartalmaznak. A benyújtott kutatási terv célja több, a Rho és Rac kis G-fehérjékre ható GTPáz aktiváló fehérje (GAP) molekuláris együttműködésének és szabályozásának felderítése neutrofil granulocitákban. Kutatócsoportunk korábban 3 Rho/Rac kis G-fehérjét mutatott ki humán neutrofil granulocitában. Az elmúlt években megklónoztunk egy további fehérjét, az ARHGAP25-öt, amely specifikusan hemopoetikus sejtekben fejeződik ki. Ezen GAP-oknak az eltérő jelpályákban való részvételének ismerete elengedhetetlen a neutrofil működések célzott módosításához. A benyújtott kutatási terv eredményei a gyógyszerfejlesztés új célpontjait tárhatják fel, és új terápiás eljárások alapjait rakhatják le.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
A neutrofil granulociták a vérben keringő fagociták legnagyobb csoportját képezik, amelyek képesek a fertőzés helyére vándorolni és a behatoló kórokozókat – elsősorban baktériumokat és gombákat – elpusztítani. Mind a túlzott, mind az elégtelen működésük, valamint a nem megfelelő helyen történő aktiválódásuk súlyos problémákat, néha gyógyíthatatlan megbetegedéseket okoz. A sejt felszínén levő, a kórokozó jelenlétét felismerő receptorokból a sejt belsejében elhelyezkedő effektor molekulákhoz történő információ-továbbítás részleteinek megismerése elengedhetetlen a neutrofil funkciók módosítását célzó eljárások kifejlesztéséhez. A kutatási terv célja egy új, a munkacsoport által a közelmúltban felfedezett szabályozó molekula, az ARHGAP25 specifikus élettani szerepének felderítése. Megvizsgáljuk az ARHGAP25 részvételét a fagociták jellegzetes funkcióiban: fagocitózisban, toxikus oxigén metabolitok termelésében, a sejtek vándorlásában valamint a baktériumölésben, és jellemezzük az ARHGAP25 aktivitását és sejten belüli elhelyezkedését módosító tényezőket. Összehasonlítjuk az ARHGAP25 szerepét más, korábban leírt hasonló fehérjék működésével. Kutatásaink eredményei kiinduló pontot nyújtanak további farmakológiai vizsgálatoknak, amelyek lehetséges új gyógyszer-támadáspontokra deríthetnek fényt.
Summary
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
The main aim of the project is to investigate the specific physiological role of ARHGAP25, the Rac GTPase activating protein (RacGAP) cloned recently by our group, in neutrophilic granulocytes PMN). The investigations will also provide important information on regulatory mechanisms controlling the activity of different RacGAPs and on the overlapping or specific roles of multiple RacGAPs expressed in the same cell. The experiments will be carried out in PMN isolated from human peripheral blood or murine bone marrow, in model cell lines, in cell-free systems, on isolated proteins and in genetically modified (ARHGAP25-deficient) mice. In isolated PMN we shall investigate the association of ARHGAP25 with the phagosome, the phosphorylation pattern of ARHGAP25 and p190GAP, search for interacting partners of RacGAPs and examine the regulation of GAPs at the expression level. We shall apply model cell lines to determine the fragments of ARHGAP25 required for association with the phagosome and to study the functional alterations following expression of wild-type or mutated RacGAPs. In the cell-free system we shall identify the RacGAPs affecting the activity of the NADPH oxidase. On isolated proteins we shall characterize the protein-lipid interactions and the effects of phosphorylation at different sites on the GAP activity. We shall isolate PMN from the bone marrow of wild-type and ARHGAP25-deficient mice, and compare their superoxide production, phagocytic and killing capacity and migration applying different types of stimulation. Depending on the results, we shall investigate suitable animal models to test the involvement of ARHGAP25 in pathological reactions.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
In the Rho/Rac family of small G proteins (smg's) the number of the regulatory GTPase activating proteins (GAPs) outnumbers 3 or 4 times the smg's belonging to this family. At present, only sporadic data are available about the specific or redundant function of the approx. 70 Rho/RacGAPs that are present in the human genome. This project aims to carry out a systematic study in neutrophilic granulocytes. Our basic question is whether ARHGAP25, the protein recently cloned by our team - and potentially other Rac/RhoGAPs described earlier in neutrophils - are embedded in molecular complexes where the interactions with protein and lipid components define their role in a specific signaling pathway. By the end of the research period, we shall have data at least on the 4 Rho/RacGAPs (ARHGAP25, p50GAP, p190GAP, Bcr) presently known in human neutrophils, and answer the question about their involvement in different neutrophil functions.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
Neutrophilic granulocytes are key elements in innate immunity, mainly by migrating to the site of infection and engulfing and degrading potentially pathogenic microorganisms. The importance of precise control of neutrophil functions is emphasized by serious diseases due to either insufficient or hyperactive neutrophil activity. Small G-proteins (smg) are involved in the regulation of all cellular processes of neutrophils. Smg's have very conserved structure and around 20 kD molecular mass. Only few regulatory mechanisms target directly the smg's. In contrast, the smg-regulatory proteins (GAP, GEF, GDI) are large, multidomain proteins offering numerous sites for molecular interactions and direct regulation by various mechanisms. The proposed project aims at deciphering the interactions and regulation of several GAPs (GTPase activating proteins) acting on Rac and Rho smg's. Our team showed earlier the expression of 3 Rac/Rho GAPs in neutrophils, and in the last years we cloned a new protein, ARHGAP25 that is expressed specifically in hematopoetic cells. Knowledge of the molecular interactions and involvement of these GAPs in specific signaling pathways is necessary for aimed modification of specific neutrophil pathways. The results of this project may disclose potential pharmaceutical targets and lay the foundation for new therapeutic approaches.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
Neutrophilic granulocytes represent the major type of circulating phagocytes that are able to migrate to the site of infection and eventually eliminate the potentially pathogenic microorganisms such as bacteria or fungi. Both inefficient and elevated activity and inappropriate site of activation of neutrophils causes severe problems, in some cases even incurable, fatal infections. Elucidation of the details of transmission of information from cell surface receptors that detect the presence of invaders to intracellular molecules that are involved in the elimination process is necessary for designing new methods for correction of neutrophil functions. The project proposes the detailed investigation of the specific, physiological role of a new regulatory molecule (ARHGAP25) that has been recently discovered by the research team. We shall determine the involvement of ARHGAP25 in various phagocyte functions such as phagocytosis, production of toxic oxygen metabolites, migration and killing of bacteria and study the mechanisms that alter the localization or activity of ARHGAP25. We shall also compare the role of ARHGAP25 to the function of other similar molecules, described earlier. Our results provide the basis for future pharmacological studies that may pinpoint potential targets for drug development.




 

Final report

  
Results in Hungarian
Az ARHGAP25, a Rac/Rho családra ható GTPáz aktiváló fehérje biológiai szerepét és szabályozását vizsgáltuk. Korábban a mi munkacsoportunk klónozta meg ezt a fehérjét, és mutattuk ki specifikus kifejeződését vérsejtekben. A jelen programban genetikailag módosított, ARHGAP25 hiányos egerekben tanulmányoztuk biológiai szerepét. ARHGAP25 hiányában a neutrophil granulociták alapfunkciói (fagocitózis, szuperoxid termelés, baktériumölés) nem változtak. Teljes állaton végzett kísérletekben lényeges változást tapasztaltunk a fehérvérsejtek mozgásában, az érpályából történő kivándorlásukban. Ezt a különbséget két eltérő gyulladásos modellben (cremaster izom, peritonitis) is kimutattuk. Leglényegesebb megfigyelésünk, hogy ARHGAP25 hiányos állatokban az autoimmun izületi gyulladás klinikai tünetei sokkal enyhébbek voltak, mint vad típusú állatban. Egy in vitro modellben kimutattuk, hogy a NADPH oxidáz szabályozásában az ARHGAP25 redundáns szerepet játszik. A fehérje aktivitását szerin-foszforiláció valamint az expressziós szint változásai szabályozzák. Eredményeink szerint tehát az ARHGAP25 fontos funkciókban specifikus módon vesz részt a neutrophil granulociták működésében, és további vizsgálatok lényeges gyógyszer támadáspontot deríthetnek fel a gyulladásos betegségek kezelésére.
Results in English
The biological role and regulation of ARHGAP25, a GTPase activating protein acting on Rac/Rho family small GTPases was investigated. Previously our group cloned this protein and showed its specific expression in hematopoetic cells. In the current project we investigated its biological role in first line in genetically modified animals lacking this protein. We did not observe any alteration in the basic functions of neutrophilic granulocytes, such as phagocytosis, superoxide production or killing of bacteria in the absence of ARHGAP25. In contrast, investigations carried out in whole animals indicated a significant alteration in leukocyte migration from the blood vessels into the interstitial space. We could verify this change in two different in vivo inflammation models (cremaster and peritonitis). Most importantly, we observed that in ARHGAP25 deficient animals the clinical symptoms of autoimmune arthritis were significantly milder than in wild type animals. In an in vitro model we demonstrated that ARHGAP25 played a redundant role in regulation of the NADPH oxidase. In respect of potential regulation of the protein we demonstrated the role of phosphorylation and of expression level regulation. Taken together, our study indicates that ARHGAP25 is involved in specific important functions of neutrophilic granulocytes and further investigations may reveal an effective drug target for curing inflammatory disorders
Full text https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=108382
Decision
Yes





 

List of publications

  
Lőrincz AM, Szarvas G, Smith SM, Ligeti E: Role of Rac GTPase activating proteins in regulation of NADPH oxidase in human neutrophils., Free Radic Biol Med. 68:65-71., 2014
Ákos M. Lőrincz, Csaba I. Timár, Krisztina A. Marosvári, Dániel S. Veres, Lilla Otrokocsi, Ágnes Kittel and Erzsébet Ligeti: Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes, Journal of Extracellular Vesicles 3. 25465-25472., 2014
Lőrincz, M. Schütte, Cs. Timár, E. Ligeti: Antibacterial extracellular vesicles from neutrophilic granulocytes are different than apoptotic bodies, Eur. J. Clin. Invest. 44. Suppl. 1., p25, 2014
Ákos M. Lőrincz*, Maria Schütte*, Csaba I. Timár*, Daniel S. Veres†, Ágnes Kittel‡, Kenneth R. McLeish§, Michael L. Merchant§ and Erzsébet Ligeti: Functionally and morphologically distinct populations of extracellular vesicles produced by human neutrophilic granulocytes, J Leukoc Biol. 2015 Oct;98(4):583-9. doi: 10.1189/jlb.3VMA1014-514R, 2015
Csépányi-Kömi R, Wisniewski É, Bartos B, Lévai P, Németh T, Balázs B, Kurz AR, Bierschenk S, Sperandio M, Ligeti E.: Rac GTPase Activating Protein ARHGAP25 Regulates Leukocyte Transendothelial Migration in Mice., Journal of Immunology 2016 Oct 1;197(7):2807-15. doi: 10.4049/jimmunol.1502342, 2016
Wang LD, Ficarro SB, Hutchinson JN, Csepanyi-Komi R, Nguyen PT, Wisniewski E, Sullivan J, Hofmann O, Ligeti E, Marto JA, Wagers AJ: Phosphoproteomic profiling of mouse primary HSPCs reveals new regulators of HSPC mobilization, Blood. 2016 Sep 15;128(11):1465-74. doi: 10.1182, 2016
Kovács F, Wisniewski É, Csépányi-Kömi R, Ligeti E: Egy új módszer kifejlesztése az ARHGAP25 GTPáz aktivitásának mérésére, MÉT 50 Vándorgyűlés absztraktok, P2.2.2, 2017
Csépányi-Kömi Roland, Pusztai Réka, Svanya Tim, Lévay Petra, Wisniewski Éva, Ella Krisztina, Südi Ágnes, Ligeti Erzsébet: RHEUMATOID ARTHRITIS IS MITIGATED IN ABSENCE OF ARHGAP25., Immunology Quarterly, 9. 3. p. 10, 2017
Roland Csépányi-Kömi,*,†,1 Éva Wisniewski,*,1 Balázs Bartos,* Petra Lévai,* Tamás Németh,* Bernadett Balázs,* Angela R. M. Kurz,† Susanne Bierschenk,† Markus Sperandio,†, and Erzsébet Ligeti*,: ARHGAP25 is a predominant regulator of leukocyte transendothelial migration in mice, European Journal of Clinical Investigation, 47 S1, p. 52, 2017
Csépányi-Kömi R, Pásztor M, Bartos B, Ligeti E.: The neglected terminators: Rho family GAPs in neutrophils., European Journal of Clinical Investigation 48 e12993, 2018
R. Csépányi-Kömi, R. Pusztai, T. Svanya, P. Lévay, É. Wisniewski, K. Ella, Á. Südy, E. Ligeti: ARHGAP25 is a crucial player in the pathomechanism of rheumatoid arthritis in mice, Eur J. Clin Invest, 48, S1, p.70., 2018
Csépányi-Kömi Roland, Domonkos Czárán, Pusztai Réka, Ana Redrado Osta, Svanya Tim, Lévay Petra, Wisniewski Éva, Ella Krisztina, Sűdy Ágnes, Ligeti Erzsébet: Possible mechanisms reducing symptoms of arthritis in Arhgap25 knockout mice, Immunológiai Szemle X. évf, 3 sz, 47. o, 2018
Lőrincz ÁM, Szeifert V, Bartos B, Ligeti E: New flow cytometry-based method for the assessment of the antibacterial effect of immune cells and subcellular particles., J Leukoc Biol. 103(5):955-963, 2018




 

Events of the project

  
2018-10-29 10:10:43
Résztvevők változása



Back »