A macska koronavírusok 3-as és 7-es régióinak funkcionális összehasonlítása
Title in English
Comparative Functional Study of the Region 3 and Region 7 of Feline Coronaviruses
Keywords in Hungarian
FECV, FIPV, ORF 3abc, ORF 7ab
Keywords in English
FECV, FIPV, ORF 3abc, ORF 7ab
Discipline
Veterinary sciences (Council of Complex Environmental Sciences)
100 %
Ortelius classification: Viral pathogens of animals
Panel
Plant and animal breeding
Department or equivalent
Institute for Veterinary Medical Research (Centre for Agricultural Research)
Participants
Bálint, Ádám Farsang, Attila Mészáros, István Olasz, Ferenc Viszovszki, Andrea
Starting date
2013-09-01
Closing date
2018-08-31
Funding (in million HUF)
43.896
FTE (full time equivalent)
7.00
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. A macska koronavírusoknak (FeCoVs) két patotípusa van: a gyakrabban előforduló tünetmentesen fertőző vagy enyhe tünetekkel járó FECV (feline enteric coronavirus) és a súlyos fertőző hashártyagyulladást okozó FIPV (feline infectious peritonitis virus). Míg a FECV a bélcsatorna szöveteiben szaporodik, addig a FIPV főleg monocitákban és makrofágokban. A betegség lefolyása a vírusok szövetspecifitásától függ, ami úgy tűnik, összefüggésben áll a vírus genom 3-as és 7-es régiójában található deléciókkal. Saját és mások adatai arra utalnak, hogy a két régióban található ORF-ek közül némelyik közvetlenül befolyásolja az FCoV-k patogenitását és a 3-as és 7-es régióból transzlálódó fehérjék kulcsszerepet játszanak a FECV replikáció tápcsatornában való fenntartásában és korlátozásában. Mindezek ellenére szinte semmit sem tudunk a konkrét funkciójukról, sőt még a pontos számuk és méretük sem ismert. Fő célkitűzésünk, hogy megismerjük a 3-as és 7-es régió működésének molekuláris mechanizmusát és tisztázzuk a régiók szerepét a FECV enterotropizmusának fenntartásában és a macskák fertőző hashártyagyulladásának kialakulásában. Ahhoz, hogy ezt a célt meg tudjuk valósítani, szeretnénk a 3-as és 7-es régiók transzkripcióját és transzlációját tanulmányozni, valamint a leíródó fehérjék lokalizációját és kölcsönhatásait feltérképezni.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. Hány mRNS íródik le az FCoV-k 3-as és 7-es régiójáról? Különböző FeCoV-k 3-as régiójában a core szekvenciák meglepően eltérő számot mutatnak. A 2-es típusú FeCoV-kben a 3-as regió mindhárom ORF-jének van egy-egy core szekvenciája, míg a legtöbb 1-es típusú FeCoV genomban csak a 3a ORF 5’ végénél található egy core szekvencia, ami arra utal, hogy a régió mindhárom ORF-je egy mRNS-ről transzlálódik. Szinte minden vírus 7-es régiójában szintén csak egy core szekvencia van a 7a ORF 5’ végénél, ami szintén azt sugallja, hogy a 7a és 7b ORF-ek egy mRNS-ről fordítódnak le. Az mRNS-ek pontos számát RT-RCR-rel fogjuk meghatározni leader specifikus és régió specifikus primereket használva.
Hány fehérje fordítódik le az FeCoV-k 3-as és 7-es régiójáról? Eukarióta mRNS-ekről általában csak az első AUG iniciál transzlációt, azonban vírusok esetében leírtak néhány kivételt ez alól a szabály alól. A lehetséges mechanizmusokat fehérje jelöléssel vizsgáljuk és a leíródó fehérjék számát és méretét is meghatározzuk.
Hogyan befolyásolják a 3-as és 7-es régió fehérjéi a FIPV szövetspecifitását? Komplementációs kísérletekben és mutáns vírusok készítésével tanulmányozzuk a 3-as és 7-es régió fehérjéinek szerepét a FIPV monocita tropizmusának kialakításában.
Mely virális és sejt fehérjék hatnak kölcsön a 3-as és 7-es régió fehérjéivel? Pull-down assay-vel és ko-immunprecipitációval azonosítjuk a kölcsönható fehérjéket.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! A kutatás eredményeként jobban megérthetjük nem csak a FeCoVs 3-as és 7-es régiójának, hanem más alfa-koronavírusok járulékos ORF-jeinek biológiai működését is. Bepillantást nyerhetünk a járulékos fehérjék leíródásának szabályozásába és megismerhetjük ezeknek a proteineknek más virális és sejt fehérjékkel való kölcsönhatásait. A kölcsönható fehérjék ismeretében feltárhatjuk azokat a molekuláris mechanizmusokat, amelyek megmagyarázhatják a genetikailag nagyon közelálló FIPV and FECV törzsek közötti szövetspecifitási és patogenitási különbségeket. A tervezett munka nagyban hozzájárulhat ahhoz, hogy jobb vakcinákat legyünk képesek fejleszteni nemcsak a FIPV, de más alfa-koronavírusok ellen is. A munkából 3-4 cikket tervezünk publikálni rangos nemzetközi állatorvosi és virológiai lapokban. A három közreműködő kutató mellett négy mesterképzésben résztvevő hallgatót is bevonunk a munkába, amely ezzel hozzájárul a tudományos képzésükhöz és minden valószínűség szerint elég anyagot szolgáltat téziseik megírásához.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. A házi macskák 20-60% fertőzött enterális koronavírussal (FECV). A vírus általában a béltraktus szöveteiben szaporodik, ami enyhe hasmenéssel járhat, de általában a fertőzés teljesen tünetmentes. Azonban a fertőzött állatok mintegy 5%-ában egy általános legyengüléssel járó gyulladásos tünetegyüttes, az úgynevezett fertőző hashártyagyulladás (FIP) alakul ki. A betegség szinte minden esetben halálos és vezető halálozási ok a fertőző betegségben kimúlt fiatal házimacskák között. Általánosan elfogadott tény, hogy a FIP kialakulásának oka a FIP vírus (FIPV) megnövekedett képessége arra, hogy bizonyos immunsejtekben (monocitákban és makrofágokban) szaporodjon. A FIPV-k és FECV-k genetikai összehasonlítása feltárta, hogy a FIPV-k többsége deléciókat hordoz a genom 3-as és 7-es régióiban. Tudományos adatok arra utalnak, hogy az ezen régiókról leíródó fehérjék felelősek azért, hogy a FECV-k csak a bélben szaporodnak és nem képesek betegséget okozni. Mindezek ellenére alig tudunk valamit ezekről a fehérjékről, még a pontos számuk és méretük sem ismert. Fő célunk hogy megismerjük azokat a molekuláris mechanizmusokat, amelyek a 3-as és 7-es régió működését szabályozzák és tisztázzuk a leíródó fehérjék szerepét a FECV enterotropizmusának fenntartásában és a FIP szindróma kialakulásában.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. Feline coronaviruses (FeCoVs) are present in two different pathotypes in the field. Feline enteric coronavirus (FECV) is more common and it causes mild or unapparent enteritis, while feline infectious peritonitis virus (FIPV) is responsible for a severe systemic granulomatous disease. FECV replication is mostly confined to the intestinal tract while FIPV replicates in monocytes and macrophages. In the case of FECV/FIPV the shift of in vivo tissue tropism correlates with virulence and the shifting of the focus of viral replication from the intestinal tract toward macrophages and monocytes goes hand in hand with deletions in the accessory region 3 and 7. Scientific data of others and our own suggest that some ORFs (especially 3c and 7a) from these regions directly influence pathogenecity of the FeCoVs. Though there is an accumulation of direct and indirect scientific evidence that accessory proteins translated from these regions might play important roles in sustaining and restricting viral replication in the intestinal tract of the host, yet to date, our knowledge about their exact function and even about their physical properties (including their precise number and size) is still very limited. Our main objective is to uncover the molecular mechanisms behind the operation of region 3 and 7 in feline coronaviruses and to clarify their role in the sustainment of FECV’s enterotropism, and in the development of systemic infection by FIPV. To achieve this goal we aim to study the transcription and the translation of region 3 and 7 of the FECV/FIPV virus pair in vitro, as well as the localization and cellular interaction of the translated proteins in different tissues.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. 1, How many mRNAs are produced from regions 3 and 7 of FeCoVs? Core sequences, the indicators of the potential mRNAs, show surprising heterogeneity in the region 3 of different FeCoVs. Serotype II FIPVs contain three core sequences, one for each ORFs. Most of the serotype I viruses have only one core sequence at the 5’end of 3a ORF which suggests that the region’s ORFs are translated from one mRNA. Region 7 of the FeCoVs has also one core sequence at the 5’end of 7a which indicates one mRNA for the translation of 7a and 7b ORFs. To determine the exact number of mRNAs we apply RT-PCR using leader specific primer as forward primer and region specific primers as reverse primers. 2, How many proteins are translated from regions 3 and 7 of FeCoVs? On eukaryotic mRNA usually only the first AUG initiates translation, though exceptions, such as reinitiation, internal initiation and leaky scanning have all been documented in viruses. The involvement of any of these mechanisms in the translation of regions 3 and 7 will be investigated by protein labeling and detection. 3, How does the proteins of regions 3 and 7 influence the tissue specificity of FIPV? We will reveal the role of the proteins of regions 3 and 7 in the monocite tropism of the FIPVs by expressing their ORFs alone and/or in combination in complementation studies and in mutant viruses. 4, Which viral and cellular proteins interact with the proteins of region 3 and region 7? It is highly possible that the accessory proteins of FECV exert their effect through protein-protein interactions. The interaction will be investigated with co-immunoprecipitation and pull-down assay.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. The planned research is expected to result in significant new insights into the function of the accessory ORFs of feline coronaviruses, with special regard to the characterization and better understanding of the regulation and cellular interactions of the translated proteins. By identifying the interacting cellular and viral proteins we hope to be able to explain the tropism and pathogenicity differences among the genetically closely related FIPVs and FECVs. The proposed work will contribute to the better understanding of the biology of the corona viruses and eventually can lead to the development of better vaccines against coronaviruses in general and against FIPV in particular. We plan to publish 3-4 papers from the project in peer-reviewed international journals with a total impact factor of 10 or more. Besides the three senior researchers and one postdoctoral fellow we intend to involve at least four Master students in the work. It is reasonable to suppose that the project will facilitate their scientific education and supply enough material for their theses.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. Feline enteric coronavirus (FECV) infection is very common around the world in domestic cats. Approximately 20 to 60% of the cats show seropositivity to the virus. FECV replication is mostly confined to the intestinal tract and the infection is usually asymptomatic or may result in mild, self-limiting gastrointestinal disease. As estimated, in around 5% of FECV infected animals, a progressive debilitating disease, feline infectious peritonitis (FIP) develops. FIP is characterized by very high mortality and it is currently the leading infectious cause of death among young domestic cats. It is generally accepted that the basic reason for the development of FIP syndromes is the enhanced replication rate of FIP virus (FIPV) in certain immune cells so called monocytes and macrophages. In the case of FECV/FIPV the shifting of the focus of viral replication from the intestinal tract toward macrophages and monocytes goes hand in hand with deletions in the genomic regions 3 and 7. There is an accumulation of scientific data that proteins translated from these regions might keep the FECVs apathogenic with restricting viral replication in the intestinal tract. However, our knowledge about their function and even about their physical parameters (including their exact number and size) is still very limited. Our main objective is to uncover the molecular mechanisms behind the operation of region 3 and 7 in feline coronaviruses and to clarify their role in the sustainment of FECV’s enterotropism and in the development of FIP.
Final report
Results in Hungarian
Feline enteric coronavirus (FECV) replication is confined to the intestinal tract and the infection is usually asymptomatic. In around 5% of FECV-infected animals, the focus of viral replication shifts from the intestines toward macrophages and monocytes, and a progressive debilitating disease, feline infectious peritonitis (FIP) develops. The FECV/FIPV transition goes hand in hand with deletions in the genomic regions 3 and 7.
We studied the transcription and the translation of the three open reading frames (ORFs) of region 3 and the two ORFs of region 7 in vivo, as well as the localization and cellular interaction of the translated proteins in different tissues in vitro. Our investigations revealed that in the majority of the type I FECVs the three ORFs of region 3 and the two ORFs of region 7 are transcribed from only one mRNA that clearly indicates non canonical translations of ORF 3b 3c and 7b. Proteins of region 7 are localized in the cytoplasm. 3a protein contains a DNA-binding and transcription activator domain, and it is localized in the nucleus and in the cytoplasm. 3b contains a DNA-binding and activator domain, and was found to localize in the mitochondrion. 3c localized in a membranous compartment in the cytoplasm but it did not co-localize with ER-Golgi network, ERGIC or peroxisomes. 3c is more stable in MARC 145 cells than in cat cells, which might reflect in vivo stability differences of 3c in natural target cells (enterocytes vs. monocytes/macrophages).
Results in English
A macska enterális koronavírus (FECV) a bélcsatorna szöveteiben általában tünetmentesen szaporodik. A replikáció fókusza a FECV fertőzött állatok körülbelül 5%-ában áttevődik a béltraktusból a makrofágokba és monocitákba, miközben az állatokban súlyos fertőző hashártyagyulladás (FIP) alakul ki. A FECV/FIPV átalakulás a vírus 3-as és 7-es régiójában kialakuló deléciókkal jár együtt.
A 3-as régió három nyitott leolvasási keretének (ORF) és a 7-es régió két ORF-jének transzkripcióját és transzlációját, valamint a leíródó fehérjék lokalizációját és kölcsönhatásait tanulmányoztuk különböző sejtvonalakban. Vizsgálataink feltárták, hogy a legtöbb 1-es típusú FECV-ben a 3-as régió három ORF-je, csakúgy mint a 7-es régió 2 ORF-je egyetlen mRNS-en íródik le. Emiatt a 3b, 3c és 7a fehérjék nem kanonikus fehérje transzlációval expresszálódnak. A 7-es régió fehérjéi a citoplazmában lokalizálódnak. A 3a fehérje egy DNS-kötő és egy transzaktivátor domént hordoz, és a nukleuszban valamint a citoplazmában lokalizálódik.
A 3b is hordoz transzaktivátor és DNS-kötő doméneket, de főleg mitokondriumokban fejti ki hatását. A 3c a citoplazma egyik membrán kompartmentjében található, de nem lokalizálódik sem az ER-Golgi hálózatban, sem ERGIC, sem a peroxiszoma részecskékben. A 3c sokkal stabilabb MARC 145 sejtekben, mint macska eredetű sejtvonalakban, ami azt sugallja, hogy ilyen stabilitásbeli különbségek előfordulhatnak a természetes célsejtekben is (enterociták vs. monociták/makrofágok).
Balka Gy, Wang X, Olasz F, Bálint Á, Kiss I, Bányai K, Rusvai M, Stadejek T, Marthaler D, Murtaugh MP, Zádori Z: Full genome sequence analysis of a wild, non-MLV-related type 2 Hungarian PRRSV variant isolated in Europe, Virus Research, 2015
Bálint Á, Balka Gy, Horváth P, Kecskeméti S, Dán Á, Farsang A, Szeredi L, Bányai K, Bartha D, Olasz F, Belák S, Zádori Z.: Full-length genome sequence analysis of a Hungarian Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus isolated from severe respiratory disease, Archives Virology, 2015
Viszovszki Andrea, Olasz Ferenc, Bálint Ádám, Hornyák Ákos, Zádori Zoltán: Egy I-es típusú FECV törzs 3-as és a FIPV-DF2 törzs 7-es régiójának in vitro transzkripciós és transzlációs vizsgálata, AKADÉMIAI BESZÁMOLÓK, 2015
lasz F, Dénes B, Bálint Á, Magyar T, Belák S, Zádori Z.: Characterisation of the nucleic acid binding features of the PRRSV 7ap and its ability to induce antinuclear antibodies, Acta Vet. Hung., 2017
Mészáros I, Tóth R, Olasz F, Tijssen P, Zádori Z.: The SAT protein of porcine parvovirus accelerates viral spreading through irreversible ER stress induction, J. Virol, 2017
Olasz F., Kádár-Hürkecz E., Bálint Á., Lakatos B., Zádori Z.: A macskák fertőző hashártyagyulladása (FIP) és az azt okozó vírus biológiája. Irodalmi összefoglaló, Magy. Állatorv. Lapja, 2017
Mészáros I, Olasz F, Cságola A, Tijssen P, Zádori Z: Biology of Porcine Parvovirus (Ungulate parvovirus 1), Viruses, 2017
Bálint Á, Farsang A, Zádori Z, Belák S.: Comparative in vivo analysis of recombinant type II feline coronaviruses with truncated and completed ORF3 region, PLoS One, 2014
Mészáros I, Olasz F, Kádár-Hürkecz E, Bálint Ádám, Hornyák Ákos, Belák S, Zádori Z: Cellular localization of the proteins of region 3 of feline enteric coronavirus, Acta Veterinaria Hungarica, 2018
Mészáros I, Olasz F, Kádár-Hürkecz E, Tamás V, Bálint Ádám, Hornyák Ákos, Belák S, Zádori Z: Cellular localization of the proteins of the region 3 of feline enteric Coronavirus, 6th European Seminar in Virology (EuSeV), 2018
Bálint Á, Farsang A, Szeredi L, Zádori Z, Belák S.: Recombinant feline coronaviruses as vaccine candidates confer protection in SPF but not in conventional cats, Veterinary Microbiology, 2014
