Plant pathology, molecular plant pathology (Council of Complex Environmental Sciences)
75 %
Bioinformatics (Council of Medical and Biological Sciences)
15 %
Plant pathology, molecular plant pathology (Council of Complex Environmental Sciences)
10 %
Panel
Complex agricultural sciences
Department or equivalent
Institute for Veterinary Medical Research (Centre for Agricultural Research)
Starting date
2013-10-01
Closing date
2017-09-30
Funding (in million HUF)
12.000
FTE (full time equivalent)
3.20
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. A cucumovírus nemzetségbe három növény vírus tartozik: az Uborka mozaik vírus, a Paradicsom magtalanság vírus és a Földimogyoró törpülés vírus. Ezek az RNS vírusok öt fehérjét kódolnak. Az 1a fehérje 993 aminosav (as) hosszúságú helikáz és metiltranszferáz funkciójú enzim. Térszerkezete ismeretlen. A szintén ismeretlen szerkezetű 2a fehérje 857 as-ból áll és polimeráz aktivitása van. Az 1a és 2a fehérje szerkezetét modern fehérjeszerkezet jósló elméleti módszerekkel kívánom előállítani és jellemezni. A modell szerkezetek minőségétől függően enzim-ligandum dokkolási számításokra és virológiai kísérletek tervezéséhez használhatóak. A 2b fehérje 110 as hosszúságú fehérje. Tetramert alkotva két duplaszálú siRNS megkötésével sikeresen gátolja a növény poszt-transzlácionális géncsendesítési folyamatát. Az első 69 as röntgenszerkezete ismert. Modellezési eredményeim alapján a hiányzó C-terminális domén szerkezetét Mg(II) ionok stabilizálják. Ezt növény virológiai kísérletekkel szeretnénk igazolni. Valamint molekuladinamikai szimulációkkal kívánom vizsgálni azt, hogy a 99-es és a 105-ös pozíciókban konzervált Trp oldalláncok betöltenek-e RNS kötést stabilizáló funkciót. Az ismeretlen szerkezetű 3a mozgási fehérje átjuttatja a vírus RNS-t a szomszédos sejtbe. A már elkezdett fehérje kristályosítási kísérleteinket szeretnénk folytatni korszerű membránfehérje kristályosítási módszerekkel. GTP kötő képességét pedig SPR módszerrel igazolni. A vírus részecskét alkotó 3b köpenyfehérje eddigi eredmények alapján aktívan részt vesz a gazda-növény kölcsönhatásban. A virion felszínén azonosított mutáció gazda faktor kötődések módosító hatását proteomikai módszerekkel kívánjuk feltárni.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. A cucumovírusoknak egyszerű szűkös génkészletük van mégis hatékonyan képesek működni. Erre a legteljesebb választ mind az öt vírus fehérje szerkezetének és funkciójának részletes megismerése után kaphatunk választ. Az öt fehérje közül csak kettőnek ismert a térszerkezete. Az 1a fehérje 993 aminosav (as) hosszúságú helikáz és metiltranszferáz funkciójú enzim. Térszerkezete ismeretlen. A szintén ismeretlen szerkezetű 2a fehérje 857 as-ból áll és polimeráz aktivitással rendelkezik. E két nagy méretű fehérje esetében az a fő kérdés, hogy milyen minőségű modelleket lehet létrehozni a mai fejlett szerkezetjósló módszerekkel. Az 1a fehérje jó minőségű modellje pl. alkalmas lehet arra, hogy azonosítsuk a természetes szubsztrát (S-adenozil metionin) kötőhelyét. Irodalmi adatok alapján az 1a fehérje és a 2a fehérje kölcsönhatása is modellezhetővé válna. Választ keresek arra, hogy a 2b fehérje C-terminális doménjén elhelyezkedő konzervált triptofán oldalláncok valóban részt vesznek-e a megkötött siRNS-ek stabilizálásában. Erre molekuladinamikai szimulációk és növény virológiai kísérletekkel egyértelmű választ kaphatunk. A 3a mozgási fehérje röntgendiffrakciós szerkezete egyszerre több kérdést is megválaszolna. Például azt hogyan képes GTP felhasználásával mozgatni az RNS-t a szomszédos sejtbe. A 3a fehérje GTP kötési állandóját SPR kísérletekkel meg lehet határozni. A vírus részecskét alkotó 3b köpenyfehérje eddigi eredmények alapján aktívan részt vesz a gazda-növény kölcsönhatásban. A virion felszínén elhelyezkedő köpenyfehérje mutáció megváltoztatja a gazda faktor kötődéseket. E jelenség molekuláris hátterére bioinformatikai és proteomikai módszerekkel keressük a választ.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! A növény virológia területén nagyon kevés szerkezeti biológiai információ gyűlt össze eddig. Nagy valószínűséggel azért, mert kevés szerkezeti biológiában jártas kutató dolgozik ilyen témákon. Pedig rendkívül fontos lenne, ha ismernénk mind az öt cucumovírus fehérje és az ezekkel kölcsönható gazda faktorok a térszerkezetét, hogy részletesen megismerhessük a vírus működési mechanizmusát. Ebben a pályázatban megfogalmaztam egy mind az öt vírus gént felölelő feladatcsomagot. A vírus replikáz komplexét alkotó két nagy méretű fehérje (1a és 2a fehérje) szerkezetének modellezése nagy mértékben elősegítené a további kísérletes munkák tervezését. A 2b fehérje C-terminális doménjén található feltételezett Mg(II) ion kötőhely igazolása jelentős eredménnyel járulna hozzá a növény virológiához. A 3a mozgási fehérje szerkezetének röntgendiffrakciós megoldása rendkívül nagy mértében elősegítené a vírus sejtről sejtre történő mozgásának megértését. A vírus részecskéhez ill. a köpenyfehérjéhez kötött gazda faktorok azonosításával és jellemzésével tisztább képet kaphatnánk a vírus-gazda kölcsönhatásokról. A pályázat keretében születendő alapkutatási eredmények közelebb vihetnek minket újabb növényvédelmi eljárások kidolgozásához.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. Az uborka mozaik vírus génállományát mindössze öt gén alkotja mégis hatékonyan képes közel ezer féle haszonnövényt fertőzni. A cucumovírusok főleg zöldségnövény és virágkertészeti kultúrákban okoznak nagy károkat. Az eredményes védekezés egyik alapja az, hogy molekuláris szinten minél teljesebben megismerjük a vírus működését. A vírusgének által kódolt fehérjék végzik el munkát a fertőzés folyamatában. Az öt fehérje közül kettő (1a és 2a fehérje) a vírus sokszorozó gépezetét építi fel. A 2b nevű fehérje igen hatékonyan fellép a növényben kialakuló védekezési folyamat ellen. A 3a mozgási fehérje aktívan segít továbbítani a vírus örökítőanyagát a növényi sejtek között. A 3b köpenyfehérjék a gömb alakú vírus részecskét építik fel. Ennek az alapkutatási pályázatnak az a célja, hogy mind az öt vírusfehérjéről újabb hasznos információkat nyerjünk. Például arra szeretnénk rájönni, hogy a 2b fehérje hogyan képes stabilan megkötni a növényben képződő RNS alapú kis védekező molekulákat. Továbbá kísérletekkel szeretnénk azonosítani, hogy a vírus köpenyfehérjéje milyen növényi eredetű védekező fehérjékkel lép kölcsönhatásba. A fehérjék szerkezeti felépítését és működésük részleteit modern bioinformatikai és kísérleti módszerek alkalmazásával fogjuk vizsgálni. A születendő alapkutatási eredmények közelebb vihetnek minket újabb növényvédelmi eljárások kidolgozásához.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. Three plant virus species belong to the cucumovirus genus: Cucumber mosaic virus, Tomato aspermy virus and the Peanut stunt virus. These RNA viruses encode for five proteins. The 993 amino acid (aa) long 1a protein is an enzyme with helicase and methyltransferase activity. The 2a protein consists of 857 aa and it is an RNA-dependent polimerase. The structures of 1a and 2a protein will be constructed with accurate protein structure prediction methods. Depending on the quality of the model structures enzyme-ligand docking calculations and experimental design might be used in plant virology. The 2b protein is 110 aa long mainly alpha helical protein. The main function of the 2b protein is to bind permanently the double stranded siRNA molecules in the post-transcriptional gene silencing process. The biologically active form is tetramer. Only partial X-ray structure is known. Modelling results showed that the missing C-terminal domain is stabilized by Mg(II) ions. We’d like to verify this computational result with plant virology experiments. As well as, molecular dynamics simulations will be carried out to check the role of the conserved Trp99 and Trp105 which are probable involved in the RNA binding. The 3a movement protein 3D structure is unknown. This transports the virus RNA to the adjacent plant cell. We’d continue our previously initiated protein crystallisation experiments using modern membrane protein crystallization kits. Furthermore the GTP binding ability will be verified with SPR technique. The coat protein (3b) is actively involved in the host-plant interactions. The host factor binding modifying effect of a point mutation will be explored with proteomic tools.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. Cucumoviruses have a simple and limited genome but they can work very effectively. We can get the most complete answers for this question when detailed understanding of all five viral protein structure and function will be available. Among the five virus protein only two 3D structures are known. The 993 amino acid (aa) long 1a protein is an enzyme with helicase and methyltransferase activity. Its 3D structure is unknown. The 2a protein structure is also unknown. This enzyme consists of 857 aa and it is an RNA-dependent polimerase. The main question is that about these two large protein, that what quality models can be created with today's advanced structure prediction methods. For example a good quality 1a protein model can be used to identify the natural substrate (S-Adenosyl methionine) binding site. Literature data suggest that 1a and 2a proteins interactions would be modelled. Furthermore we intend to explore that the conserved tryptophan side chains of 2b protein C-terminal domain are really involved in the stabilization of the bound siRNAs. For this question plant virology experiments and molecular dynamics simulations can give clear answer. The X-ray structure of the 3a movement protein would answer several questions. For example, how can it move the viral RNA to the adjacent plant cell using GTP. The GTP binding dissociation constant of the 3a protein can be determined by SPR experiments. The 3b coat protein of the virus are actively involved in the host-plant interactions. A point mutation in the coat protein significantly alters the host factor pattern. The molecular background of this phenomenon might be answered with bioinformatics and proteomics methods.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. In the field of plant virology very few structural biology data is accumulated to date. Mainly because of only few researchers who are experienced in structural biology working on these topics. However, it is utmost importance to unravel the whole proteome structure of cucumoviruses to gain further insight into the detailed mechanism of the virus infection process. In this research proposal a set of unresolved tasks were collected which covers all five virus genes. The modelling of the two large protein (1a and 2a) structures which form the replicase complex of the virus would greatly facilitate the design of further experimental work. Thus predicted theoretical models should significantly promote the structure based characterization of these proteins. Verifying the putative Mg(II) ion binding site on the 2b C-terminal domain would contribute to the knowledge of plant virology with significant result. The X-ray structure determination of the 3a movement protein substantially would help to understand the cell-to-cell movement of the viral RNA. In this project we intend to unravel the molecular background of viral and host protein interactions focusing on the coat protein related host factors. Further in-depth molecular biology and molecular modelling studies on the interaction between viral and host proteins will decidedly add new aspects to the emerging picture on cucumoviral host factor interactions. The expected results of this basic research may bring us closer to the development of new crop protection methods.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. The Cucumber mosaic virus has only five genes but it can efficiently infect nearly one thousand kinds of farm crops. Cucumoviruses cause serious losses to agriculture worldwide, principally in vegetable and ornamental cultures. The successful protection opportunities strongly require that we have to obtain more detailed knowledge about virus functions at molecular level. The proteins encoded by virus genes carried out all work in the infection process. Two of the five proteins (1a and 2a proteins) build up the multiplying machinery of the virus. The so called 2b protein makes an effective action against the defense mechanism of plants. The 3a protein is actively transfers the virus RNA between the plant cells. The coat proteins (3b) assemble the spherical virus particles. The main goals of this basis research proposal are that to obtain more useful information about all five viral proteins. For example, we would like to discover that how 2b protein is able to stably bind to the defensive small RNAs which formed in the plant defense process. Furthermore we would like to experimentally identify those host factors from plant tissues which make interactions with the 3b coat protein. The structures and functions of these viral proteins will be explored with modern bioinformatics and experimental methods. The expected results of this basic research may bring us closer to the development of new crop protection methods.
Final report
Results in Hungarian
Cucumovírus fehérjék proteomikai és szerkezeti biológiai kutatásainkból eddig két magas impakt fakoros közlemény született egy harmadik pedig hamarosan benyújtásra kerül. Az első cikkünk a Plos One online tudományos folyóiratban jelent meg, ahol a CMV 2b fehérje átfogó un. alanin-szkenninges kísérletsorozatát mutattuk be. A 2b fehérje siRNS-sel alkotott ribonukleo-protein komplex modellezésével szerkezeti biológiai alapokon magyaráztuk a kísérleti eredményeket. Két mutáns befolyásolta a 2b fehérje szupresszor aktivitását. Míg másik két mutáns esetében kimutattuk, hogy a 2b fehérje a vírus sejtről-sejtre való terjedésében kölcsönható partnerként játszik fontos szerepet. A második közlemény a rangos Scientific Reports-ban jelent meg, ahol molekuladinamikai szimulációkkal is támogatva igazoltuk, hogy azonosítottunk egy új kettős foszforilációs helyet a CMV 2b fehérjében. Ezen keresztül történik a 2b fehérje siRNS kötésének szabályozása ill. sejten belüli elhelyezkedése irányítása. Harmadik fontos eredményünk, hogy találtunk egy olyan CMV mutáns vírust, ami meglepő módon blokkolja az kloroplasztiszban található ATP szintáz F1 motor komplex forgását, ami hozzájárul a súlyos törpüléses és szövetelhalásos tünetekhez. Ezt a furcsa jelenséget elektron mikroszkópos és módosított ELISA kísérletekkel igazoltuk. Molekulamodellezési szaktudásomat és erőforrásaimat más virológiai együttműködésekben is sikeresen fel tudtam használni.
Results in English
Two original research papers with high impact factors were published in the field of our cucumovirus research and a third will be submitted soon enough. The first was published in Plos One where a comprehensive alanine-scanning of CMV 2b protein was presented. CMV 2b-siRNA ribonucleoprotein molecular models were created to illustrate the experimental results on structural biological basis. We identified two triplets necessary for the suppressor function of the 2b protein and two other positions were required for cell-to-cell movement of the virus. The second was published Scientific Reports where a conserved dual phosphorylation switch was identified in CMV 2b protein, which equilibrates the shuttling of the 2b protein between the nucleus and the cytoplasm, and regulates the suppressor activity of the 2b protein. Molecular dynamics simulations were computed the native and modified 2b protein tetramer–siRNA ribonucleoprotein complexes in order to see the main conformational changes. Our third important result is about a mutant CMV which elicits unusual symptoms. The mutant CMV capsid can lethally block the rotation of the ATP synthase F1 motor complex which may lead to severe stunting and necrotic symptoms. We managed to verify the direct interaction of the ATP synthase and the mutant CMV capsid with electron microscopy and modified ELISA experiments. In the frame of this project I successfully used my molecular modelling skills and resources in other virological cooperations.
Eszter Mihalov-Kovács, Ákos Gellért, Szilvia Marton, Szilvia L. Farkas, Enikő Fehér, Miklós Oldal, Ferenc Jakab, Vito Martella, Krisztián Bányai: Candidate New Rotavirus Species in Sheltered Dogs, Hungary, http://real.mtak.hu/26598/, 2015
A kutatás helye megváltozott. Korábbi kutatóhely: Alkalmazott Genomikai Osztály (MTA Agrártudományi Kutatóközpont), Új kutatóhely: Állatorvos-tudományi Intézet (MTA Agrártudományi Kutatóközpont).
