Genomszintű mRNS és kis RNS transzkriptom vizsgálata és jellemzése Capsicum annum-ban.
Title in English
Genome wide mRNA and small RNA transcriptome profiling and characterization in Capsicum annuum.
Keywords in Hungarian
paprika, kisRNS, mRNS, genom, fejlődés
Keywords in English
pepper, smallRNA, mRNA, genome, development
Discipline
Plant breeding (Council of Complex Environmental Sciences)
50 %
Plant gene bank basic research (Council of Complex Environmental Sciences)
30 %
Development, developmental genetics, pattern formation and embryology (Council of Medical and Biological Sciences)
20 %
Panel
Plant and animal breeding
Department or equivalent
Agricultural Biotechnology Institute (ABC) (National Agricultural Research and Innovation Centre)
Participants
Bálint, Jeannette Barta, Endre Dalmadi, Ágnes Jaksa-Czotter, Nikoletta Kaló, Péter Kis, András Oláh, Enikő Etelka Pesti, Réka Várallyay, Éva Varga, Tünde
Starting date
2013-09-01
Closing date
2017-11-30
Funding (in million HUF)
43.984
FTE (full time equivalent)
7.08
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. A növényi fejlődési folyamatokat az mRNS-ek és a kis szabályozó RNS-ek összefüggő és hatékonyan szabályozott rendszere befolyásolja (kontrollálja). Napjaink egyik legintenzívebben kutatott tudományos területe a mind állatokban, mind növényekben jelenlevő, kis szabályozó RNS-ek világának felfedezése. Az új generációs mélyszekevenálási technológiák megjelenése új utat nyitott a komplex, RNS–ek által szabályozott, folyamatok megismerésében és megértésében. A modell organizmusok tanulmányozásáról a termesztett növények tanulmányozására való áttérés azonban új kihívást jelent. A pályázat célja, hogy részletes információt gyűjtsön különböző Capsicum annuum (paprika) fajták RNS transzkriptomjának expressziójáról (működéséről). A paprika Magyarország fontos termesztett növénye: Hungarikum. Kutatásaink során mélyszekvenálási eljárással meghatározzuk paprikafajták különböző szöveteinek mRNS (RNSszek) és kisRNS (sRNSszek) profilját illetve létrehozzuk a paprika vázlatos genom szekvenciáját. Az így nyert adatok összehasonlító bioinformatikai elemzésével azonosítunk már ismert és új paprika specifikus kis RNS-(miRNS és siRNS)-eket. Az ígéretes kis RNS-ek biológiai fontosságát a legkorszerűbb molekuláris biológiai módszerekkel vizsgáljuk tovább. Az ősi (kis termés és eltérő növekedési erély) és a modern paprikafajták összehasonlító elemzése során azonosíthatóak lesznek az olyan kis RNS-ek és mRNS-ek, melyek kulcsfontosságúak a gazdaságilag fontos tulajdonságok kialakításában. Kutatásunk nemcsak leírja majd a paprika szervfejlődés során fontos szabályozó RNS-eket, hanem további részleteket fed fel a kis szabályozó RNS-ek növényfejlődésben betöltött általános mechanizmusáról.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. A projekt alapvető kérdése az, hogy a paprika különböző fejlődési folyamataiban hogyan és milyen mértékben épülnek egymásra az mRNS-eken és kisRNS-eken alapuló szabályozó folyamatok. Napjaink kutatásainak eredményei azt mutatják, hogy az RNS interferencia folyamataiban résztvevő kis szabályozó RNS-ek (miRNS-ek és siRNS-ek) megdöbbentően nagymértékben befolyásolják a sejt fejlődési irányát meghatározó mRNS-ek expressziós aktivitását. A kis szabályozó RNS-ek szerepének tanulmányozása elsősorban egyelőre a modell organizmusokra korlátozódott. Munkánk során mi fontos termesztett fajták (paprika) különböző szöveteiben kívánjuk felderíteni az mRNS-ek expresszióját befolyásoló kis reguláló RNS-ek szerepét, hogy megérthessük, milyen folyamatok állnak a fejlődési folyamatok kialakulásának hátterében. A javasolt projekt konkrét kérdései és céljai: (i) hogyan viszonyul egymáshoz (miben hasonlít és miben különbözik) a genomszintű mRNS és kis RNS transzkriptom különböző szervekben, fejlődési stádiumokban (ii) tudunk-e különbséget detektálni a szervfejlődésben konzervatívan előforduló kis RNS-ek között, (iii) lehetséges-e azonosítanunk új paprika (és akár fajta) specifikus kis RNS-eket és validálni cél mRNS-üket, (iv) tudunk-e az ősi, vad és a modern fajták RNS transzkriptomjának összehasonlításával azonosítani olyan konzervatív, vagy paprika specifikus kis RNS-eket és mRNS-eket, melyek szerepet játszanak a kis, vad típusú termés gazdaságilag fontos zöldség terméssé való átalakulásában, (v) mi az azonosított miRNS-ek működési mechanizmusa paprikában? Azt reméljük, hogy eredményeink a kis RNS alapú mRNS szabályozás néhány növényekben általános új aspektusát is megmutatják majd.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! Napjainkban az új generációs szekvenálási eljárások fejlődésének és hozzáférhetőségének köszönhetően új időszak kezdődött a biológiai folyamatok genom szintű analízisében. Ez a technológia lehetővé teszi egész genomok szekvenálását és genomszintű információt nyújt a vizsgált szövetben vagy sejtben expresszálódó RNS fajtákról. A mélyszekvenálás eredményeképpen kapott adatok értelmezése és analízise ma a biológiai tudományterületek egyik legélénkebben kutatott iránya. A genomtudományok élmezőnyéhez való felzárkózás elkerülhetetlen számunkra, ha használni akarjuk a fontos, értékes, hazai fajták genomjának vagy az általuk expresszált RNS-eknek genomszintű adatait. A genomszintű adatok értékelése segíthet minket abban, hogy megérthessünk alapvető biológiai folyamatokat és/vagy javíthassunk gazdaságilag fontos tulajdonságokon. E cél elérése érdekében tervezzük az mRNS-ek és a kis szabályozó RNS-ek expressziós mintázatának genomszintű analízisét különböző paprika (Capsicum annuum) fajták különböző szöveteiben illetve a vázlatos paprika genom létrehozását. Ez a projekt összhangban van ez egész világot behálózó törekvéssel, mely a modell szervezetek mellet a gazdaságilag fontos haszonnövények tanulmányozását célozza annak érdekében, hogy a növények közötti hasonlóságok és különbségek megállapításával információt nyerhessünk a gazdaságilag fontos tulajdonságok kialakulásáról. A paprika nagyon fontos haszonnövény Magyarországon (“hungarikum”) és a Solonaceae család egyik legkevésbé kutatott tagja így ezen adatbázisok létrehozása és elemzése jelentős előnyhöz juttathat minket a versenytársakkal szemben. A paprika specifikus kis RNS-ek és a különböző fajták kis RNS-ei által szabályozott mRNS-ek kapcsolatainak felderítése értékes eredmény lesz. Az ősi és a modern fajták összehasonlító elemzése információt nyújt azon változásokról, melyek az mRNS és kis RNS profilban a vad típusú tulajdonság modern, gazdaságilag fontos jellegé (pl. termés méret) való átalakulása során következtek be. Ezen kísérletek azonosítanak majd olyan specifikus mRNS-eket és/vagy kis RNS-eket, melyek a gazdaságilag fontos tulajdonság kialakulásáért felelősek, így hosszútávon segíthetnek a gazdaságilag fontos növények további nemesítésében.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. A kis, nem kódoló RNS-ek által kifejtett szabályozási hálózat, melyet napjainkban fedeztek fel, egy új, nélkülözhetetlen szabályozási szintet képvisel, mely a már expresszált mRNS-ek aktivitását befolyásolja. Az mRNS-ek kis RNS-ek által közvetített regulációja létfontosságú mind a növények, mind az állatok fejlődési folyamataiban. Munkánk során mélyszekvenálással kívánjuk vizsgálni különböző Capsicum annum (paprika) fajták (ősi, primitív és modern, gazdaságilag fontos) különböző szöveteinek komplex mRNS és kis RNS profilját illetve meghatározni paprika vázlatos genom szekvenciáját. A mélyszekvenálási módszer lehetővé teszi, hogy egyszerre több százezer expresszáló RNS molekulát (mRNS és miRNS) vizsgáljunk, így reprezentatív adatot kaphatunk a vizsgált szövetre. Különböző minták genom szintű analízise és szisztematikus összehasonlítása lehetővé teszi, hogy azonosítsunk olyan fontos mRNS-eket és/vagy kis RNS-eket, melyek fontos szerepet játszanak a paprika fejlődésében. A miRNS-ek és target mRNS-eik legmodernebb molekuláris biológiai módszerekkel való vizsgálata bizonyítja majd a vizsgált RNS-ek biológiai fontosságát. A tervezett kísérletek fontos, paprika specifikus kis RNS-ek és a vad típusú jelleg modern, gazdaságilag fontos jelleggé (pl. termés méret) válása során megváltozott mRNS – kis RNS profilok azonosítását eredményezhetik. A paprika nagyon jelentős haszonnövény Magyarországon (“hungarikum”), így fontos, hogy nemesítését a modern genomikai megközelítések felhasználásával is támogassuk.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. Plant development processes are under the highly coordinated and interconnected control of mRNAs and small regulatory RNAs. One of the most intensively studied scientific fields of our days is the exploration of the small regulatory RNAs world present in plants and animals. The availability of the new generation deep sequencing technologies opened a new way to study and to understand the complex RNA mediated regulatory processes. The new challenge is to extend the experiments to crop species from the model organisms. The aim of this proposal to gain detailed insight into the tissue specific expression of RNA transcriptoms of different Capsicum annuum (pepper) cultivars. Pepper is an important crop in Hungary and has been considered as a "hungaricum". Deep sequencing technology will be used to determine mRNA (RNA-seq), small RNA (sRNA-seq) profiles of different pepper tissues and to establish the draft genome of the pepper. Using the data sets, comparative bioinformatics approaches will be used to identify known and new pepper specific regulatory small RNAs (miRNAs and siRNAs). The biological relevance of the promising candidate small RNAs will be investigated with most developed molecular biology techniques. Comparative analyses of ancient cultivars (small fruits and different growing habitat) and modern cultivars will be done in order to identify small RNAs and/or mRNAs playing pivotal roles in the development of economically important traits. This research will reveal not only important regulatory RNAs during the pepper organogenesis but will provide also mechanistic data on the mode of action of small regulatory RNAs during the plant development in general.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. The fundamental question of this proposal is that how and what extent is the mRNA and small RNA regulatory network interconnected in different developmental processes in pepper. Recent researches revealed the unexpectedly high impact of RNA silencing associated small regulatory RNAs (miRNAs and siRNAs) on the expression activity of mRNAs determining mainly the developmental commitment of the cells. However, the investigations of the complex regulatory RNA networks are primarily focused on model plants. In this proposal we would like to unravel the regulatory small RNA control on the mRNA expressions transcriptions in different tissues of an important crop species (pepper) to understand the regulation mechanism lying behind the altered developmental processes. The concrete questions and aims of the proposed projects (i) how do the genome wide mRNA and miRNA transcriptom compositions relate to each other in various organs and in different developmental stages (ii) can we detect altered expression of conservative small RNAs playing role in organ development, (iii) is it possible to identify pepper (species) specific new miRNAs and validate their target mRNAs, (iv) can we identify conservative or pepper specific small RNA and mRNAs playing role in the transition of the small wild type pepper fruit to the economically important vegetable fruit of the modern cultivars by comparison of the RNA transcriptomes of ancient wild type peppers and modern cultivars, (v) what is the molecular bases of the action of the investigated small RNAs in pepper? We hope that these experiments will also reveal new aspects of small RNA based mRNA regulation in general in plants.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. In recent years a new area of genome wild analyses of biological processes has begun with the development and the open availability of new generation sequencing methods. This technology allows full sequencing of whole genomes or/and provides information at genome scale on the expressed RNA species present in the investigated tissues or cell types. Acquiring and analyzing data produced by deep sequencing technology is one of the hottest topics of the scientific fields in biology. It is inevitable for us to catch up to the fronts of genomic sciences in order to harness the outcomes of genome wide data analyses of genomes and/or expressed RNAs of important species, valuable national cultivars. Genome scale data analyses will help us to understand of basic biological processes and/or improve of economically important traits. In order to achieve this goal the genome wild analyses of the complex expression patterns of mRNAs and small regulatory RNAs (miRNA and siRNAs)in different pepper (Capsicum annuum) tissues, different pepper cultivars and the establishment of draft genome sequence of pepper are proposed. This project is in line with worldwide efforts to study not only the model plants but also economically important crops to reveal the similarities and differences between plant species and provide information on the developmental aspects of economically important traits. Pepper is very important crop ("hungaricum") in Hungary and less intensively investigated than other Solenaceae plants. Consequently, the establishment and the analyses of these databases will provide us significant advantage over the competitors. The identification of pepper specific small RNAs and the connection of small RNA mediated mRNA regulations to specific phenotypes would be valuable findings. The comparative analyses of ancient and modern cultivars will provide information on changes of mRNA and small RNA profiles during the transition of wild type traits to modern economically important traits (e.g., fruit size). These experiments may identify specific mRNAs and/or small RNAs responsible for the improved formation of economically important traits helping to improve in long term this economically important crop.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. The recent discovery of small non-coding RNAs mediated gene-regulatory mechanism revealed a new, indispensable regulatory network acting on the activities of the already expressed mRNAs. Small RNAs mediated regulation of mRNAs have been shown to play a pivotal role in the developmental processes in both plants and animals. In the proposed research the complex mRNA and small RNA profiles of different Capsicum annum (pepper) tissues of different pepper cultivars (ancient primitive and economically important cultivars) will be investigated by deep sequencing method. The deep sequencing method allows the representative analyses of tens of thousands expressed RNA molecules (mRNAs and small RNAs) present in the investigated tissues and also the establishment of draft genome sequence of pepper. The genome wide analyses of different samples and their systematic comparison will identify important mRNAs and/or miRNAs playing role in development of pepper. The subsequent analyses of small RNAs and their target mRNAs by cutting edge molecular biology methods will reveal the biological significance of the investigated RNA species. The outcome of the proposed experiments would be the identification of important pepper specific small RNAs and the determination of mRNA and small RNA profiles during the transition of wild type traits to modern economically important traits (e.g., fruit size). Since pepper is very important crop ("hungaricum") in Hungary it is important to assists its improvement with the utilization of the achievement of modern genomic approaches.
Final report
Results in Hungarian
Új generációs szekvenálási eljárásokat (NGS) felhasználva meghatároztuk egy modern paprikafajta és a paprika vadtípusú ősének a kis és mRNS profilját különböző fejlődési stádiumokban. Nagy felbontású szövet specifikus információ érdekében a paprika termést mag, placenta és hús mintákra bontottuk fel a késői fejlődési stádiumokban. Összehasonlító differenciál expressziós analízissel bemutattuk, hogy a konzervált, már leírt és az általunk azonosított új kis RNS-ek fokozott szabályozási aktivitást mutatnak a paprika termés expanziója során. Kidolgoztunk egy gél szűrés alapú kromatográfiás eljárást biológiailag aktív kis RNS-ek azonosítására. Ezt az eljárást alkalmaztuk paprika mag, hús és placenta vizsgálata esetén is. Az azonosított kis RNS–fehérje komplexek RNS tartalmát NGS technológiával meghatároztuk. Ezek az adatok nyújtják az első átfogó szövet specifikus kis RNS expressziós mintázatot húsos termés kialakulása során. Számos új, magas expressziójú, szövet és paprika specifikus kis RNS típust azonosítottunk. Az adataink arra utalnak, hogy termés növekedés nagymértékben szabályozott különböző kis RNS-ek által. Különböző metodikai eljárásokat és vizsgáltunk, amelyek segíthetnek a jelölt RNS-eink pontos biológiai szerepének meghatározásában, mint vírus indukálta gén csendesítés, mesterséges miRNS technológia, paprika genetikai transzformálása és részt vettünk a Nicotiana benthamina kis RNS profiljának meghatározásában is.
Results in English
Using next generation sequencing (NGS) we determined the small (s) and mRNA profiles of a modern cultivar and wild type pepper at several fruit developmental stages. To gain high resolution tissue specific information we dissected the fruit for placenta, seed and flesh at later developmental stages. We demonstrated with comparative differential expression analyses of conserved, already described and our newly predicted pepper-specific sRNAs revealed that fruit expansion is accompanied by an increasing level of sRNA-mediated regulation of gene expression. We also elaborated a size separation chromatography based identification of biologically active sRNA species. This methodological approach has been applied on pepper tissues (flesh, seed and placenta). SRNA content of the identified protein complexes and protein unbound small RNA species was sequenced with NGS. These data provide the first comprehensive tissue-specific sRNA expression landscape for a developing fleshy fruit. We identified and several novel, abundantly expressing tissue- and pepper-specific small regulatory RNA species. Our data show that fruit expansion is under extensive tissue-specific sRNA-mediated regulation. We also investigated technological approaches helping to analyse the biological role of candidate RNA species such as, virus induced gene silencing, artificial miRNA technology, genetic transformation of pepper and took part in sRNA profiling of Nicotiana benthamia.
Kis A, Tholt G, Ivanics M, Várallyay É, Jenes B, Havelda Z.: Polycistronic artificial miRNA-mediated resistance to Wheat dwarf virus in barley is highly efficient at low temperature., Mol Plant Pathol. 2015 Jul 1. doi: 10.1111/mpp.12291., 2015
Baksa I, Nagy T, Barta E, Havelda Z, Várallyay É, Silhavy D, Burgyán J, Szittya G.: Identification of Nicotiana benthamiana microRNAs and their targets using high throughput sequencing and degradome analysis., BMC Genomics. 2015 Dec 1;16:1025. doi: 10.1186/s12864-015-2209-6., 2015
Oláh E, Pesti R, Taller D, Havelda Z, Várallyay É.: Non-targeted effects of virus-induced gene silencing vectors on host endogenous gene expression., Arch Virol. 2016 Sep;161(9):2387-93. doi: 10.1007/s00705-016-2921-9. Epub 2016 Jun 9, 2016
Nagy T, Kis A, Poliska S, Barta E, Havelda Z, Marincs F.: Comparison of small RNA next-generation sequencing with and without isolation of small RNA fraction., Biotechniques. Jun 1;60(6):273-8., 2016
Events of the project
2016-03-09 13:37:58
Résztvevők változása
2015-08-24 15:21:49
Résztvevők változása
2014-01-02 14:42:01
Kutatóhely váltás
A kutatás helye megváltozott. Korábbi kutatóhely: (Nemzeti Agrárkutatási és Innovációs Központ), Új kutatóhely: Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóintézet (Nemzeti Agrárkutatási és Innovációs Központ).
