Új eljárások oligonukleotiddal vezérelt enzimatikus DNS-metilációra
Title in English
New approaches for oligonucleotide-targeted enzymatic DNA methylation
Keywords in Hungarian
biokunjugálás, olgonukleotid, peptid nukleinsav, DNS metiltranszferáz, DNS metiláció, SNAP-tag, DNS hármas spirál
Keywords in English
bioconjugation, oligonucleotide, peptide nucleic acid, DNA methyltransferase, DNA methylation, SNAP-tag, triple helix
Discipline
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)
50 %
Ortelius classification: Molecular design, de novo design
Organic, Biomolecular, and Pharmaceutical Chemistry (Council of Physical Sciences)
30 %
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)
20 %
Ortelius classification: Enzimology
Panel
Genetics, Genomics, Bioinformatics and Systems Biology
Department or equivalent
Institute of Biochemistry (HUN-REN Biological Research Centre Szeged)
Participants
Szentes, Sarolta Zsibrita, Nikolett
Starting date
2013-09-01
Closing date
2017-08-31
Funding (in million HUF)
27.290
FTE (full time equivalent)
8.07
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. Emlősökben a gének promoterében lévő CpG helyek citozinjainak C5-metilációja a gén működésének kikapcsolásához vezet. Kiválasztott CpG helyek célzott metilálása fontos módszer lehet a DNS-metiláció és az epigenetikus szabályozás biológiai szerepének vizsgálatában. Az irányított DNS-metiláció azon az elven nyugszik, hogy egy DNS (citozin-5) metiltranszferázt (C5-MTáz) egy irányító doménhez kapcsolnak, amely a metilálni kívánt CpG hely közelében kötődik a DNS-hez. Eddig többnyire cink-ujj fehérjéket (ZFP) használtak irányító doménként. Erre a szerepre ígéretes alternatívát jelentenek a tripla helix képzésére alkalmas oligonukleotidok (TFO) és a peptid-nukleinsavak (PNA). TFO és PNA molekuláknak irányító doménként való felhasználásánál az egyik nehézség az, hogy nincs jó, általánosan használható módszer a MTáz-hoz való kapcsolásra. A pályázatban új módszereket javaslunk a C5-MTáz-TFO kapcsolásra. Munkánk során két CG-specifikus MTázt, a bakteriális M.SssI-et és a humán Dnmt3a MTáz katalitikus doménjét kívánjuk használni. Az egyik tervezett módszerben fúziót hozunk létre a MTázok és az ún. SNAP-tag fehérje között. A SNAP-tag a humán O6-alkilguanin-DNS-alkiltranszferáz egy módosított változata. A TFO/PNA egy, a SNAP-tag által katalizált enzimatikus reakcióban kerülne át a fúziós fehérjére. A másik módszerben nem-kovalens kölcsönhatások segítségével fogjuk a MTáz végére épített ciszteint és a TFO/PNA reaktív csoportját egymáshoz közel hozni és ezzel a kovalens kötés kialakulását indukálni. A TFO/PNA-MTáz konjugátumok DNS-metilációs specifitását in vitro és humán szövettenyészet sejtjeiben in vivo fogjuk vizsgálni.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. A tervezett kutatás célja annak kidolgozása, hogy hogyan lehet triplex-formáló oligonukleotid (TFO) és peptid nukleinsav (PNA) molekulákat célzott DNS-metilációra emlős sejtekben felhasználni. A célzott DNS metilációra kidolgozott eddigi próbálkozások irányító doménként szinte kizárólag szekvenciaspcifikus DNS-kötő fehérjéket használtak. TFO-t irányító doménként eddig egyetlen munkában használtak (van der Gun et al. 2010, Bioconjugate Chem.21: 1239-1245, a pályázók társszerzőségével), míg PNA ilyen felhasználásáról nem tudunk. A tervezett munka középpontjában olyan módszerek kidolgozása áll, amelyek segítségével C5-DNS metiltranszferázokat jó hatásfokkal és az enzimaktivitás megőrzésével tudjuk TFO/PNA-hoz kapcsolni.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! Az epigenetikus szabályozás kutatása jelenleg a molekuláris biológia egyik legizgalmasabb területe. Az epigenetikus szabályozás biztosítja, hogy a gerincesekben az azonos genetikai információ ellenére a szöveti differenciálódás olyan sokféle sejtet és sejtfunkciót hoz létre. Magasabbrendű eukariotákban az epigenetikus szabályozás bonyolult rendszerében a DNS (citozin-5) metiláció egyike a legfontosabb epigenetikus faktoroknak. Bár ez a legrégebben vizsgált is, még csak most kezdjük megérteni, hogyan jön létre és hogyan változik a genom metilációs mintázata, és ennek milyen következményei vannak egészséges és beteg sejtekben. Különösen nehéz feladat kideríteni a DNS-metiláció és más epigenetikus tényezők közötti viszonyt. A mesterségesen előidézett helyspecifikus DNS metiláció kitűnő kísérleti eszköz lenne az epigenetikus szabályozás vizsgálatához. A célzott DNS-metilációra kidolgozott eddigi módszerek azonban nem kerültek be a molekuláris biológia eszköztárába. Ennek egyik oka a nem kellő mértékű metilációs specifitás lehet. Az eddig közölt módszerek nagy többségében cink-ujj fehérjéket (ZFP) használtak irányító doménként. Nem minden kötőhelyre könnyű megfelelő ZFP-t előállítani, ezért indokolt más típusú irányító doméneket keresni. A pályázat célja annak megvizsgálása, hogy tripla helix képző oligonukleotidok (TFO) és peptid nukleinsavak (PNA) alkalmasak-e az irányító domén szerepének betöltésére. A tervezett módszer a DNS metiláció kutatásának fontos eszköze és terápiás alkalmazások kiindulópontja is lehet.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. A magasabbrendű élőlények, így az ember DNS-ében is a citozinok (C) egy része metilált formában, 5-metilcitozinként van jelen. A DNS metilációnak fontos szerepe van a génműködés szabályozásában és egyes betegségek, pl. a rák kialakulásában. A gének meghatározott szakaszainak metilálása a gén működésének kikapcsolásához vezet. A pályázat olyan új módszerek kidolgozását tűzi ki célul, melyek segítségével a genom egyes kiválasztott citozinjai szelektíven metilálhatók és ezáltal egyes gének működése kikapcsolható. A tervezett módszerek fontos kísérleti eszközeivé válhatnak a DNS-metiláció kutatásának, hozzájárulhatnak a genom információtartalmának megértéséhez és kiindulópontjai lehetnek terápiás alkalmazásoknak.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. In mammals C5-methylation of cytosines in CpG sites located in the promoters of genes leads to gene silencing. Targeted DNA methylation of selected CpG sites in the genome would be a powerful technique for studying the biological roles of DNA methylation and epigenetic regulation. The concept of targeted DNA methylation is based on covalently linking a DNA (cytosine-5) methyltransferase (C5-MTase) to a targeting domain, which can bind to DNA in the vicinity of the addressed CpG site. In most studies so far zinc finger proteins (ZFP) were used as targeting domain. Triple helix-forming oligonucleotides (TFO) and peptide nucleic acids (PNA) are promising alternatives to ZFPs as targeting devices. One of the problems associated with the use of TFO or PNA molecules as targeting domain is that there is no generally applicable method available for coupling to C5-MTases. Here we propose new approaches to couple C5-MTases to TFO and PNA molecules. Two CG-specific MTases, the bacterial M.SssI and the catalytic domain of the human Dnmt3a will be used. In the first approach genetic fusions will be constructed between the MTases and the SNAP-tag, a modified human O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase. Coupling will be achieved by SNAP-tag-mediated enzymatic transfer of the TFO/PNA onto the fusion protein. In the second approach non-covalent interactions will be used to bring a C-terminal Cys and reactive groups on the TFO/PNA in close proximity to induce specific covalent bond formation. DNA methylation specificity of the TFO/PNA-MTase conjugates will be tested in vitro and in vivo in cultured human cells.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. The goal of the planned research is to develop methods for the use of triplex forming oligonucleotides (TFO) and peptide nucleic acids (PNA) for targeted DNA methylation in mammalian cells. The different approaches of targeted DNA methylation have so far used almost exclusively sequence specific DNA binding proteins as targeting domains. TFO was used in one study (van der Gun et al. 2010, Bioconjugate Chem.21: 1239-1245, with co-authorship of the applicants), and we are not aware of any publication reporting the use of PNA as targeting domain. The planned work will mainly focus on the development of techniques that can be used to efficiently couple DNA (cytosine-5) methyltransferases to TFO/PNA without losing enzymatic activity.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. The research of epigenetic regulation is one of the most exciting fields of current molecular biology. Epigenetic regulation ensures that in spite of the same genetic information stored in their DNA, cells of vertebrate organisms differentiate into many different forms and perform vastly different functions. In higher eukaryotes DNA (cytosine-5) methylation is one of the most important factors in the intricate network of epigenetic regulation. Although DNA methylation is the most researched epigenetic mark, we are only at the beginning of understanding how the DNA methylation pattern is established, maintained and modified in health and disease. An especially difficult task is to understand the relationship between DNA methylation and the other epigenetic factors. The ability to site-specifically target DNA methylation to pre-determined sites in the genome would be very helpful in the study of epigenetic regulation. The methods that have been developed so far for targeted DNA methylation have not become standard research tools. One possible reason for that is the insufficient degree of methylation specificity. Most published methods used zinc finger proteins (ZFP) as targeting domain. However, for some sequences it is not easy to design ZFP with the required specificity. Therefore, the effort to find alternative targeting devices is justified. The goal of proposal is to test, whether triplex forming oligonucleotides (TFO) and peptide nucleic acids (PNA) can be used as targeting domain. The method envisioned by this proposal can become a powerful technique in DNA methylation research, and may lead to therapeutic applications in the future.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. In the DNA of higher organisms, including humans, some of the cytosine nucleobases occur in methylated form (5-methylcytosine). DNA methylation plays important roles in gene regulation and in the pathogenesis of some disease states such as cancer. Methylation of specific parts of the genes turns off gene expression. The proposal aims to develop approaches that can be used to selectively methylate predetermined cytosines in the genome and silence the specific genes. The envisaged methods can become important experimental tools in DNA methylation research, can contribute to our understanding of genomic information, and can lead to therapeutic applications in the future.
Final report
Results in Hungarian
1) Azzal a céllal, hogy felderítsük, lehet-e célzott DNA metilációra triplex-formáló-oligonukleotidokat (TFO) irányítódoménként használni, Dr. Elmar Weinhold csoportjával (RWTH Aacheni Egyetem) együttműködve eljárást dolgoztunk ki a CG-specifikus M.MpeI DNS metiltranszferáz és TFO SNAP-tag által katalizált kapcsolására. A TFO-SNAP-M.MpeI konjugátummal in vitro rendszerben plazmidon kimutattuk, hogy a TFO kötőhely közelében lévő CG hely nagyobb gyakorisággal metilálódott, mint a plazmidon.
2) Annak érdekében, hogy jobban oldható és tisztítható komplementáló MTáz fragmentumokat kapjunk, az M.MpeI és az ugyanolyan specifitású M.SssI MTázból cirkulárisan permutált (CP) változatokat állítottunk elő. A 14 cpM.MpeI változat közül 11, míg a 7 cpM.SssI változat közül 6 mutatott MTáz aktivitást. Ez az első példa DNS MTázok tervezett CP változatainak létrehozására.
3) Kidolgoztunk egy egyszerű módszert fehérjék szekvenciaspecifikus DNS-kötésének kimutatására E. coliban.
Results in English
1) To explore the possibility of using triplex-forming-oligonucleotides (TFO) as targeting domains for targeted DNA methylation, we have, in collaboration with Dr. Elmar Weinhold (RWTH Aachen University), developed a method for the SNAP-tag mediated enzymatic coupling of the CG-specific M.MpeI DNA methyltransferase and TFO. We have shown in an in vitro system using plasmid DNA substrate that the TFO-SNAP-M.MpeI conjugate preferencially methylated the CG site located in the vicinity of the TFO binding site.
2) During the effort to obtain complementing fragments of M.MpeI and M.SssI, which are sufficiently soluble and can be purified, we constructed circularly permuted (CP) variants of the two methyltransferases. Of the 14 cpM.MpeI variants 11 and of the 7 cpM.SssI variants 6 had detectable methyltransferase activity. This is the first case when designed CP variants of DNA methyltransferases.
3) We have developed a simple E. coli assay to detect sequence-specific binding of proteins to DNA.
Pál Albert, Bence Varga, Nikolett Zsibrita and Antal Kiss: Circularly permuted variants of two CG specific prokaryotic DNA methyltransferases, A Molekuláris Élettudományi Konferencia 2017, Eger rendezvényen poszterként szerepelt, 2017
Sarolta Szentes, Eszter Zsigmond, Pál Salamon and Antal Kiss: A simple genetic system to study sequence-pecific DNA-binding proteins in E. coli, A Molekuláris Élettudományi Konferencia 2017, Eger rendezvényen poszterként szerepelt, 2017
