 |
Here you can view and search the projects funded by NKFI since 2004
Back »
|
 |
Details of project |
|
|
| Identifier |
109847 |
| Type |
K |
| Principal investigator |
Horváth, Ákos |
| Title in Hungarian |
Halsperma vitrifikációja |
| Title in English |
Vitrification of fish sperm |
| Keywords in Hungarian |
hal, sperma, mélyhűtés, vitrifikáció |
| Keywords in English |
fish, sperm, cryopreservation, vitrification |
| Discipline |
| Pisciculture, fishery (Council of Complex Environmental Sciences) | 80 % | | Animal breeding (Council of Complex Environmental Sciences) | 10 % | | Ortelius classification: Animal breeding | | Animal reproduction biology (Council of Complex Environmental Sciences) | 10 % |
|
| Panel |
Plant and animal breeding |
| Department or equivalent |
Institute for Aquaculture and Environmental Safety (Hungarian University of Agriculture and Life Sciences) |
| Participants |
Bokor, Zoltán
Urbányi, Béla
|
| Starting date |
2014-01-01 |
| Closing date |
2016-12-31 |
| Funding (in million HUF) |
26.367 |
| FTE (full time equivalent) |
4.80 |
| state |
closed project |
Summary in Hungarian A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
A kutatás célja a halsperma vitrifikációja az eddig alkalmazott mélyhűtési technikák egyszerűsítése és jobb termékenyülési eredmények elérése érdekében. A vitrifikáció a víz vagy vizes oldatok amorf, kristályos jégképződéssel nem járó megszilárdulása, amely során kiküszöbölhetők a jégkristályok okozta sérülések és javítható a lehűtött sejtek túlélése. A vitrifikációs eljárások csak az utóbbi időben kezdenek elterjedni a halsperma-mélyhűtés területén, mivel használatuk általában feltételezi a toxikus védőanyagok magas koncentrációját. A projekt keretében három fő kutatási irányt tervezünk követni: a halsperma vitrifikációját védőanyagok jelenlétében, a halsperma védőanyag-mentes vitrifikációját, illetve a sperma nyomássokkos kezelését a mélyhűtést megelőzően annak érdekében, hogy fokozzuk a mélyhűtés károsító hatásaival szembeni ellenálló képességét. A védőanyagok jelenlétében végzett vitrifikáció célja, hogy megállapítsuk a vitrifikációhoz szükséges védőanyag-összetételt és koncentrációt, illetve a megfelelő eszközt. A védőanyag-mentes vitrifikáció során célunk vizsgálni különböző összetevők (szarvasmarha szérum albumin, tömény cukoroldat, szeminális folyadék) hatását a vitrifikáció sikerességére és a sejtek túlélésére. A nyomássokk vizsgálata során a hidrosztatikus nyomás korábban közölt kedvező hatását kívánjuk vizsgálni a mélyhűtendő sejtek túlésére. A kapott eredmények alapján olyan halfajokra kívánunk gyakorlati mélyhűtési módszert kifejleszteni (pl. zebradánióra), amelyekben az általánosan használt fagyasztásos eljárások csak korlátozott sikerhez vezettek.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
A kutatás alapkérdése, hogy a halsperma vitrifikációja lehet-e valódi alternatíva a jelenleg alkalmazott fagyasztásos mélyhűtéssel szemben. A pillanatnyilag használt halsperma-mélyhűtési eljárások közös hátránya, hogy a spermiumoknak csak egy része éli túl a mélyhűtést, ami ráadásul fajonként változó. A helyesen végrehajtott vitrifikáció elvileg ezt a problémát küszöböli ki. A kutatás további fontos kérdései közé tartozik a védőanyagok toxicitása, illetve az azok hatásának kitett hímivarsejtek túlélése az expozíciós időt és a mélyhűtést követően. Mivel a jelenlegi ismereteink szerint a vitrifikáció kizárólag igen magas védőanyagkoncentrációk mellett képzelhető el, meg kívánjuk vizsgálni, hogy ilyen körülmények között egyáltalán lehetséges-e a halsperma megfelelő minőségű vitrifikációja. A védőanyag-mentes vitrifikáció vizsgálatakor az alapkérdés az, hogy az így lehűtött minták valóban vitrifikálódnak-e, vagy csak egy ultragyors fagyasztásról és részleges vitrifikációról van-e szó. Az eddigi ismeretek alapján a vitrifikáció védőanyagok nélkül nem lehetséges, ugyanakkor az utóbbi időben több olyan tudományos publikáció jelent meg, ami a humán és halsperma védőanyag nélküli vitrifikációjáról számol be. Végül a harmadik részfeladat fő kérdése, hogy halban is működik-e a hidrosztatikus nyomássokk kanspermában leírt kedvező hatása a sejtek mélyhűthetőségére. Az eddigi irodalmi adatok szerint a nyomássokk megnöveli a sejtek hősokk-fehérje termelését, ami pedig közvetlen összefüggésben áll a sperma mélyhűtés iránti toleranciájával.
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
A halsperma sikeres vitrifikációja jelentősen növelné az ivarsejt-mélyhűtés hatékonyságát és csökkentené annak költségeit. A vitrifikáció során elkerülhető a sejteket a mélyhűtés során érő két fő károsító tényező: a fokozatosan besűrűsödő oldatok által okozott ozmotikus sokk, valamint a nagyméretű jégkristályok képződésével járó fizikai károsodás. Potenciálisan így a vitrifikáció akár az eredetileg lehűtött sejtek 100%-ának túlélését is eredményezheti. A közelmúltban megjelent közlemények egy része ezt az elméletet látszik igazolni, mivel a szerzők szivárványos pisztráng spermáját mélyhűtve 80% körüli felolvasztás utáni motilitásról számoltak be, ami a korábban használatos fagyasztásos mélyhűtési eljárások mellett elképzelhetetlen volt. Ráadásul a szerzők mindezt toxikus védőanyagok használata nélkül érték el, ami tovább növeli az ilyen módszerek használatának előnyeit. Amennyiben ezeket a módszereket sikerül adaptálnunk több, a halgazdálkodás és a laboratóriumi modellállat tenyésztés szempontjából fontos halfajra, új lehetőségek nyílnak meg mind a gyakorlati tenyésztési alkalmazás, mind a fajmegőrzési munka előtt. Számos kisméretű laboratóriumi halfaj (pl. zebradánió, medaka) spermamélyhűtése megoldatlan vagy az alkalmazott módszerek a gyakorlatban nehezen használhatók a kinyerhető ivartermék kis mennyisége miatt. A vitrifikációs eljárásokban a kis mennyiség nem jelent hátrányt, mivel a kedvezőbb felszín-térfogat arány miatt az üvegképződés esélye is nagyobb az ilyen mintákban. A gazdasági haszonhalakban a veszteségmentes ivarsejtmélyhűtés, illetve a drága eszközpark (programozható mélyhűtő készülék) szükségtelensége jelenthet előnyt a hagyományos fagyasztással szemben.
A kutatás harmadik részfeladatában foglalt nyomássok jelentősége is abban áll, hogy javítja a sejtek mélyhűtéssel szembeni toleranciáját, felkészíti a sejteket a mélyhűtés károsító hatásaira, így megnöveli a túlélésük esélyeit. A hidroszatikus nyomás kiváltására használt eszköz kereskedelmi forgalomban kapható, így a nyomássokkot üzemi körülmények között is ki lehet váltani. A nyomássokk és fagyasztás, illetve vitrifikáció kombinálása együttesen járulna hozzá a pályázat általános céljához, azaz a mélyhűtés hatékonyabbá és olcsóbbá tételéhez.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
A kutatás célja a halsperma mélyhűtési módszereinek javítása a jobb hatékonyság és alacsonyabb költségek elérése érdekében. Az élő anyag (sejtek, szövetek) mélyhűtése és tárolása lehetővé teszi azok túlélését emberi léptékkel korlátlan ideig. A halak esetében a sperma mélyhűtése fontos segítséget jelent a tenyésztő- és nemesítőmunka számára, valamint a különböző fajok genetikai tartalékainak megőrzésében. Az eddig alkalmazott mélyhűtési módszerek a spermát tartalmazó oldat fagyasztásával jártak együtt, amit csak a lehűtött sejtek egy része élt túl. A víz és vizes oldatok mélyhűtésének van azonban egy másik módja, az üvegszerű amorf szilárd állapotot eredményező vitrifikáció, ami nem jár kristályos jég képződésével. Ez kiküszöböli a kristályos jég okozta sejtkárosodásokat, ugyanakkor eléréséhez nagy mennyiségű védőanyag használatára van szükség, ami ilyen koncentrációban mérgező a sejtekre. A fenti okok miatt a vitrifikációt eddig nem tartották alkalmasnak halsperma mélyhűtésére. A legújabb szakirodalmi adatok alapján azonban a halsperma vitrifikációja lehetséges védőanyagok alkalmazása nélkül is. A pályázati munka során különböző tenyésztett és laboratóriumi halfajok spermáját szeretnénk vitrifikáció útján mélyhűteni és azt felhasználni termékenyítésre. A vitrifikáció által a spermiumok túlélése jelentős mértékben javítható, illetve a járulékos költségei csökkenthetők, mivel eléréséhez nincs szükség költséges eszközök (pl. programozható hűtőgép) beszerzésére. A mélyhűtési eljárások eredményességének további javítására szeretnénk alkalmazni a szakirodalomban nemrég leírt nyomássokkot is.
| Summary Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
The objective of this research is vitrification of fish sperm in order to simplify existing cryopreservation techniques and achieve better fertilization results. Vitrification is the amorphous, non-crystalline solidification of water or aqueous solutions which eliminates damages attributed to ice crystals and improves cell survival following cryopreservation. Vitrification has started gaining popularity in fish sperm cryopreservation only recently as its use generally requires the employment of high concentrations of toxic cryoprotectants. In this project we plan to follow three main research directions: vitrification of fish sperm in the presence of cryoprotectants, cryoprotectant-free vitrification of fish sperm as well as the pressure shock treatment of sperm prior to cryopreservation in order to increase the resistance of cells to the damaging effects of cryopreservation. The objective of vitrification in the presence of cryoprotectants is to determine the cryoprotectant composition and concentration and well as the suitable tool for vitrification. The goal of cryoprotectant-free vitrification is to test the effects of different components (bovine serum albumin, concentrated sugar solutions, seminal plasma) on the success of vitrification and cell survival. In the experiments on pressure shock, we wish to test the beneficial effect of hydrostatic pressure on the survival of cryopreserved cells that was reported earlier. Results will allow the development of practical cryopreservation methods for fish species (such as the zebrafish) where traditional cryopreservation methods resulted in only limited success.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
The fundamental question of this research is whether vitrification of fish sperm can be a real alternative to the cryopreservation by freezing that is commonly applied today. The common disadvantage of currently used fish sperm cryopreservation methods is that only a part of spermatozoa survive cooling and thawing and this survival is species specific. Properly conducted vitrification can theoretically overcome this problem. Another important question of this research is the toxicity of cryoprotectants and survival of spermatozoa following exposure to cryoprotectants and cryopreservation. As according to our current knowledge, vitrification is only possible with the use of high concentrations of cryoprotectants we wish to investigate whether sperm survival is possible at all in these conditions. In the tests on cryoprotectant-free vitrification, the main question is whether this cooling is true vitrification or only a version of ultra-fast freezing and partial vitrification. According to our current knowledge, vitrification is not possible without cryoprotectants, yet recently several studies have been published on the cryoprotectant-free vitrification of human and fish sperm. Finally, the main question of the third work package is whether the beneficial effect of hydrostatic pressure that was described in boar sperm will also occur in fish sperm. According to the available information, pressure shock increases the heat shock protein production of cells which in turn is in direct relationship with the cryoresistance of cells.
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
Successful vitrification of fish sperm would greatly increase the efficiency of gamete cryopreservation and reduce its costs. Vitrification allows the elimination of the two main factors responsible for damages to cells during cryopreservation: osmotic shock due to solute effects as well as physical damage caused by ice crystals. Thus, potentially vitrification can lead to a 100% survival of cryopreserved cells. Some of the recently published studies seem to confirm this hypothesis as following the cryoprotectant-free vitrification of rainbow trout sperm authors reported post-thaw motilities of 80% which was unattainable with the freezing methods used previously. In addition, these results were achieved without the use of toxic cryoprotectants which increases the advantages of these methods. If these method can be applied to several commercially important or laboratory model fish species, it would open new frontiers for aquaculture as well as conservation biology use of cryopreservation. The cryopreservation of the sperm if several laboratory model fish species (e.g. zebrafish, medaka) is problematic or impractical due to the low volume of sperm that can be collected. Low volume does not represent any disadvantage in vitrification as the chances of successful glass formation are higher in smaller samples due to the better surface-volume ratios. In cultured fish species, advantages include lossless sperm cryopreservation and the needlessness for expensive equipment (programmable freezer).
The importance of pressure shock in the third work package is that improves the cryoresistance of cells, prepares them for the damaging effects of cryopreservation, thus, increases the chances of their survival. Tools necessary for the application of hydrostatic pressure are commercially available, thus, pressure shock can be applied even in farm conditions. Pressure shock and cryopreservation by either freezing or vitrification can contribute together to the general objective of this project, the improved reliability and cost efficiency of cryopreservation.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
The objective of this project is the improvement of fish sperm cryopreservation methods for better reliability and cost efficiency. Cryopreservation of live matter (cells, tissues) allows their survival for an infinite period of time in human terms. In fish, sperm cryopreservation is an important tool for breeding and genetic improvement as well as for conservation of genetic resources of various fish species. Cryopreservation methods used to date included the freezing of the solution containing the spermatozoa which led to the survival of only a part of the cells. There is however another method of cryopreservation of water or aqueous solutions: vitrification that results in a glass-like amorphous solid state which does not involve the formation of ice crystals. This can eliminate the damages associated with the formation of crystalline ice, however, it requires the use of high concentrations of cryoprotectants that are toxic for the cells. Thus, vitrification was nor considered a suitable method for fish sperm cryopreservation. However, according to the latest literature data cryoprotectant-free vitrification of fish sperm is possible. In this project, we plan the vitrification of the sperm of several fish species and its use for fertilization. Sperm survival can greatly be improved by vitrification and its additive costs can be reduced as the purchase of expensive equipment (such as a programmable freezer) is not necessary. The pressure shock described recently will also be used for a further improvement of cryopreservation methods.
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
List of publications |
|
|
| Eszter Kása, Gergely Bernáth, Tímea Kollár, Daniel Żarsk, Jelena Lujić, Zoran Marinović, Zoltán Bokor, Árpád Hegyi, Béla Urbányi, M Carmen Vílchez, Marina Morinic, David S Peñaranda, Luz Pérez, Juan F Asturiano, Ákos Horváth: Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla), GEN COMP ENDOCR :, 2016 | | Juan F Asturiano, Elsa Cabrita, Ákos Horváth: Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review, GEN COMP ENDOCR In Press:, 2017 | | Sonia Martínez-Páramo, Ákos Horváth, Catherine Labbé, Tiantian Zhang, Vanesa Robles, Paz Herráez, Marc Suquet, Serean Adams, Ana Viveiros, Terrence R Tiersch, Elsa Cabrita: Cryobanking of aquatic species, AQUACULTURE In Press:, 2017 | | Eszter Kasa , Dusan Jesensek , Gergely Bernath , Timea Kollar , Zoltan Bokor , Bela Urbanyi , Akos Horvath: Vitrification of the sperm of salmonid species, The 22nd International Congress of Zoology, 14-19. November 2016, Book of abstracts p. 421., 2016 | | Kása E., Vílchez M.C., Morini M., Penaranda D.S., Pérez L., Asturiano J.F., Urbányi B., Horváth A.: Vitrification of the sperm of European eel (A. anguilla): Investigation of different protocols, Aquaculture Europe 2014, Donostia-San Sebastián, Spain, October 14-17, 2014, book of abstracts pp. 616-617., 2014 | | Kása, E., Bernáth, G., Kollár, T., Zarski, D., Lujic, J., Marinovic, Z., Bokor, Z., Hegyi, Á., Urbányi, B., Horváth, Á.: Vitrification of the Sperm of Eurasian Perch (Perca fluviatilis), 7th International Conference Water & Fish, Belgrade, Serbia, June 10-12. 2015, pp. 303-308., 2015 | | Kása E, Bernáth G, Kollár T, Żarski D, Lujić J, Marinović Z, Bokor Z, Hegyi A, Urbányi B, Vílchez MC, Morini M, Peñaranda DS, Pérez L, Asturiano JF, Horváth A: Vitrification of fish sperm, 5th International Workshop on the Biology of Fish Gametes, Ancona, Italy, 7-11. September 2015, Book of abstracts p. 106-107., 2015 | | Kása E, Bernáth G, Kollár T, Żarski D, Lujić J, Marinović Z, Bokor Z, Hegyi A, Urbányi B, Vílchez MC, Morini M, Peñaranda DS, Pérez L, Asturiano JF, Horváth A.: Development of Sperm Vitrification Protocols for Freshwater Fish (Eurasian Perch, Perca Fluviatilis) And Marine Fish (European Eel, Anguilla Anguilla), General and Comparative Endocrinology, submitted, 2016 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
