g-tubulin komplex poszttranszlációs szabályozása növényi tubulin nukleációban és sejtciklus kontrollban
Title in English
Posttranslational regulation of γ-tubulin complex in plant microtubule nucleation and cell cycle control
Keywords in Hungarian
g-tubulin, in vitro transzláció, protein kináz, foszforiláció, ALPHAScreen
Keywords in English
g-tubulin, in vitro translation, protein kinase, phosphorylation, ALPHAScreen
Discipline
Molecular biology (Council of Medical and Biological Sciences)
60 %
Ortelius classification: Molecular biology
Cell biology and molecular transport mechanisms (Council of Medical and Biological Sciences)
30 %
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)
10 %
Ortelius classification: Biochemistry
Panel
Cellular and Developmental Biology
Department or equivalent
Dept. of Molecular Biology (Semmelweis University)
Participants
Nagy, Szilvia Krisztina
Starting date
2014-04-01
Closing date
2018-03-31
Funding (in million HUF)
17.172
FTE (full time equivalent)
2.80
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. A növények jól meghatározott térbeli szerkezete és de novo organogenezise a sejtosztódás és a sejtlemez orientáció szigorú kontrollján keresztül jön létre. A mikrotubulus polimerek az intracelluláris szerkezet kialakításának és a sejtosztódásnak elengedhetetlen komponensei, így a mikrotubulusok tér- és időbeli szabályozása döntő jelentőségű a növényi növekedés és fejlődés szempontjából. A mikrotubulus nukleáció általában a mikrotubulus organizáló központokhoz köthető (MTOC), amelyeknek egyik fő komponense az evolúciósan konzervált γ-tubulin fehérje. A többi eukariótával ellentétben a növényi mikrotubulus polimerek nem jól definiálható MTOC-kból erednek, hanem a sejtekben szétszórtan elhelyezkedő γ-tubulin pozitív helyekről. Míg a centroszómális eredetű mikrotubulus nukleáció részletesen feltárt folyamat, addig centroszóma nélküli megfelelőjére vonatkozó ismereteink nagyon hiányosak. Az MTOC keletkezése és nukleációs aktivitása egyaránt poszttranszlációsan szabályozott. Az állati és élesztő γ-tubulint több kináz is foszforilálja, és előzetes eredményeink alapján a növényi γ-tubulin is módosulhat kinázok közreműködésével. Napjaink kutatási eredményei alapján a γ-tubulin az E2F transzkripciós faktorral heterodimert képez, így a sejtciklus G1/S fázisának szabályozásában is szerepet játszik. Együttműködő partnerünk hasonló megfigyeléseket tett a növényi γ-tubulin esetében. A pályázatban ismertetett kísérletekkel az előzetes eredményeinket kívánjuk részletesen tanulmányozni, és a γ-tubulin komplexekben található kináz-szubsztrát kapcsolatokat feltárni.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. Előzetes eredményeink alapján a stressz válaszban résztvevő AtMPK6 és a sejtciklus regulátor CDK egyaránt foszforilálhatja a növényi γ-tubulint. Munkánkkal azonosítani kívánjuk a foszforilált aminosavakat, majd mutagenezissel nem foszforilálalható, illetve konstitutív foszforiláltságot utánzó változatokat hozunk létre. A mutáns változatokkal a prágai csoport γ-tubulin géncsendesített növényeket transzformál, így a mutációk fiziológiás következményeit is vizsgálhatjuk. Várakozásaink szerint ezek a kísérletek segítenek megérteni a sejtlemez képződés stressz és sejtciklus általi kettős szabályozottságát. A prágai laboratórium korábbi vizsgálataival a γ-tubulin fehérje komplexben számos fehérje kinázt azonosított. A kináz funkció feltárásának egyik elengedhetetlen lépése a szubsztrátok azonosítása. Ennek megfelelően az azonosított kinázok néhány karakteres képviselőjét előállítjuk in vitro transzlációval, és ennek segítségével in vitro foszforiláljuk a γ-tubulin komplexet. Az MS-sel azonosított, feltételezett szubsztrátokat előállítjuk, és in vitro megerősítjük az MS eredményeket. Figyelembe véve az ismert növényi fehérje kinázok ismert szubsztrátjainak alacsony számát, ezek az eredmények a növénybiológusok szélesebb körének érdeklődésére is számot tarthatnak. A γ-tubulin mostanság ismertté vált G1/S fázisban betöltött szerepét növényben még nem vizsgálták. Kísérleteinkkel tanulmányozzuk az Arabidopsis E2F fehérjék és γ-tubulin heterodimer formáló képességét és a kialakuló komplexek DNS kötő képességét. A kapott adatok a γ-tubulin eddig ismeretlen szerepét demonstrálhatják, ily módon új megvilágításba helyezhetik a növényi sejtciklus szabályozás mechanizmusát.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! A többsejtű élőlények a sejtosztódás aktivitásának és orientációjának szabályozásán keresztül alakítják ki szerkezetüket. A sejtosztódás szabályozásában a citoszkeletonnak, azon belül pedig a mikrotubulusoknak kiemelt szerepe van. A mikrotubulus polimerizáció az MTOC-okból, állatok esetében elsősorban a γ-tubulint tartalmazó centroszómákból ered. Habár a növények nem rendelkeznek centroszómaszerű képletekkel, esetükben is a rendezett mikrotubulus polimerek koordinálják a sejtosztódást és megnyúlást. A foszfoproteomikai vizsgálatok γ-tubulint tartalmazó centroszómák különböző kinázok általi foszforilációját már igazolták, a centroszómán kívüli γ-tubulin komplexekre vonatkozóan azonban hasonló adat nem áll rendelkezésünkre. A γ-tubulin mikrotubulus nukleációban betöltött funkciója ismert, az egyéb esetleges szerepei azonban továbbra is vita tárgyát képzik. Egy meglepő felfedezés szerint a γ-tubulin a sejtciklus G1/S fázisának is fontos komponense lehet. A pályázat a γ-tubulin poszttranszlációs szabályozásának vizsgálatára ad javaslatot egy nemzetközi együttműködés keretében, összekapcsolva sejtbiológiai és biokémia tapasztalatokkal rendelkező laboratóriumokat. A várt új ismeretek a sajátságos növényi mikrotubluláris polimerizáció és sejtciklus szabályozás részletesebb értelmezését tehetik lehetővé. A γ-tubulin CDK és MAPK foszforilációs helyeinek azonosítása, és ezek funkcionális következményeinek vizsgálata megvilágíthatja a sejtosztódás sejtciklus és stressz által történő kettős szabályozásának molekuláris részleteit. A γ-tubulin protein komplex kináz-szubsztrát kapcsolatainak leírása hozzájárulhat a diszperz MTOC-ok keletkezésének és működésének megértéséhez. Végül pedig annak igazolása, hogy a növényi γ-tubulin a humán sejtekben leírtakhoz hasonlóan heterodimert formál az E2F fehérjékkel, így szerepet játszik a G1/S fázis szabályozásában, új megvilágításba helyezheti a növényi sejtciklus szabályozásra vonatkozó ismereteinket. A sejtosztódás nem csak növények alakját, de növekedését is meghatározza, így a sejtosztódásban több szinten is részt vevő γ-tubulin tanulmányozása mezőgazdasági szempontból is hasznos információkkal szolgálhat.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. A többsejtű élőlények sejtjei szigorúan rendezett, ugyanakkor rugalmas, folyamatosan változó belső szerkezettel rendelkeznek. Ezt a kétarcú szervezettséget minden élőlényben a sejtváz biztosítja. A sejtváz egyik fő komponense a hosszú csöveket formáló tubulin polimerek képezik, melyek a sejt igényeinek megfelelően folyamatosan növekszenek, illetve lebomlanak. A mikrotubulusok folyamatos polimerizációs, depolimerizációs ciklusa felelős többet között a sejtosztódás aktivitásának és irányának szabályozásáért, így nem meglepő módon egy finoman szabályozott folyamat. A legtöbb élőlényben a polimerizációért a jól meghatározott mikrotubulus organizációs központok felelősek, növényekben azonban nem találunk ilyen képleteket. A pályázat a növényi mikrotubulusok működésének feltárására irányul, melyhez nemzetközi együttműködés keretében kívánjuk vizsgálni a folyamat egyik fő felelős fehérjéjét, a γ-tubulint. A kollaboráló laboratóriumok mind felszereltségben, mind szakmai tudásban kiegészítik egymást, a magyar partner rendelkezik egy általa optimalizált, speciális in vitro biológia metodikával és az ehhez szükséges eszközökkel, míg a cseh kutató csoport sokéves sejtbiológiai tapasztalatával járulhat hozzá a pályázat sikeréhez. A mikrotubulusok térbeli és időbeli keletkezésének kontrollja döntő jelentőségű a növényi fejlődés és növekedés szempontjából, így a várt eredményeink nem csak az alapkutatásban bírnak fontossággal, de mezőgazdasági szempontból is jelentősek lehetnek.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. Plants establish their overall three-dimensional shape and initiate de novo organogenesis by strictly controlled orientation of division plate and cell cycle activity. The microtubule polymers are essential components of intracellular organization and cell division; therefore, the spatial and temporal control of microtubule array nucleation is decisive in plant growth and development. Microtubule nucleation is typically localized to microtubule-organizing centers (MTOCs), and one of the main components of these protein complexes is the evolutionary conserved γ-tubulin. In contrast to other eukaryotes, plant microtubule arrays do not originate from discrete centrosome-like organizing centers, but from dispersed γ-tubulin positive locations of cells. The centrosomal microtubule initiation is a well-known mechanism, however molecular details of non-centrosomal microtubule nucleation is much less understood. Formation and microtubule nucleation activity of MTOCs is regulated by posttranslational modifications. Phosphorylation of γ-tubulin by different kinases has been demonstrated in animal and yeast cells and we have shown phosphorylation of γ-tubulin in plants too. Recent findings indicate that γ-tubulin also plays role in G1/S transition of cell cycle by formation of heterodimer with E2F transcription factor. Similar interaction of plant γ-tubulin and E2F has been demonstrated by our collaborating partner. The proposed experiments aim at detailed description and functional studies of our preliminary findings, and identification of novel signaling cascades of plant γ-tubulin protein complexes.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. According to our previous results, γ-tubulin can be phosphorylated by AtMPK6, a mitogen activated kinase responsible for stress responses and by CDK, a kinase involved in cell cycler regulation. We will identify the amino acid residues which are subjected to phosphorylation and mutagenize γ-tubulin on the relevant amino acids to mimic and block phosphorylation by the studied kinases. The Prague laboratory will transform their γ-tubulin silenced plants with the mutant constructs to study the physiological consequences of mutations. The expected result will provide clues about the mechanism of double balanced regulation of cell division plate formation. The collaborator’s laboratory analyzed the composition of γ-tubulin complex by mass spectrometry (MS) and has found several associated protein kinases. The first step to understand the function of any given kinase is the identification of its substrates. To this end, we will produce characteristic identified protein kinases by in vitro translation and use them for in vitro phosphorylation of γ-tubulin complex. The putative, MS identified substrates will be confirmed by in vitro kinase assays. Considering the very limited number of known plant protein kinase substrates, the expected data could be also interesting for the wider plant scientist community. The recently described, cell cycle regulator function of γ-tubulin has not been studied in plants yet. We will study the formation of different E2F-γ-tubulin heterodimers and measure the E2 DNA binding capacity of different complexes. The obtained results could reveal a yet unknown function of plant γ-tubulin and change our present view about plant cell cycle regulation.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. Multicellular organisms form their structure and overall shape by regulating the activity and orientation of cell division. The cell division is controlled by cytoskeleton, specifically by microtubular arrays nucleated from MTOCs such as centrosomes with γ-tubulin as the key molecular player. Despite lacking discrete MTOCs, higher plant also assemble highly ordered arrays of microtubules that coordinate cell division and expansion. Although the first phosphoproteomic studies suggested that function of centrosomal γ-tubulin complexes is regulated by cyclin dependent kinases and stress signalling, the similar phosphoproteomic data are still missing for acentrosomal γ-tubulin and its complexes. While primary function of γ-tubulin in microtubule organization is accepted, its further roles beside microtubule nucleation are still debated. One of the most striking findings is that γ-tubulin could be directly involved in regulation of G1/S phase transition. The proposal aims to describe the role of posttranslational modification in regulation of γ-tubulin by bringing together complementary expertise of plant cell biologists and biochemists. The acquired knowledge will provide insights into the unique mechanism of plant microtubule nucleation and cell cycle regulation, two central issues of plant growth and development. Identification of CDK and MAPK phosphorylation sites will aid understanding the delicately balanced connection of cell division with cell cycle regulation and stress responses. Description of presently unknown kinase-substrate partners of γ-tubulin protein complexes will provide important clues about machinery of plant γ-tubulin positive dispersed MTOCs that are required the formation of microtubule arrays. Confirming that plant γ-tubulin also heterodimerize with E2F transcription factors thus has similar function in plants will put the plant cell cycle regulation in new light. Plant cell division determines the shape and growth rate of plants, and γ-tubulin seems to be playing role in several ways in its regulation; therefore, further understanding of its function is also important from the agricultural point of view.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. Cells of multicellular organism are highly organized structures with a flexible, dynamically changing yet strictly defined interior. This double feature of intracellular organization is ensured by the cytoskeleton in all organisms. One of the main components of cytoskeleton is the hollow cylindrical polymer of microtubules, which continuously grows and degrades according to the cells’ need. The polymerization and depolymerization cycle of microtubule arrays is a delicately controlled procedure and determines activity and orientation of cell division. In most multicellular organism, the growing of microtubule polymers is mainly initiated by microtubule organizing centers but plants are devoid of this definitive subcellular structure. The presented proposal aims to deepen our understanding about organization of plant microtubule arrays. To this end, we bring together the expertise and instrumentation of international laboratories to reveal the unique function of the evolutionary conserved γ-tubulin in plants. The Hungarian partner provides the biochemical background, while the Czech laboratory carries out the physiological studies in plants. Our goal is the detailed description of regulation of γ-tubulin and its associated proteins by applying special methods developed in our laboratory. Considering that spatial and temporal control of microtubule array nucleation is decisive in plant growth and development, the expected results of our research activity is equally important from the basic science and agricultural point of view.
Final report
Results in Hungarian
A pályázat eredeti célkitűzésének megfelelően tanulmányoztuk a γ-tubulin sejtciklus szabályozásban betöltött szerepét. Kísérleteink megerősítették munkahipotézisünket, miszerint γ-tubulin kölcsön hat az E2F transzkripciós faktorokkal, és a DP fehérjével azonos kötőhelyen keresztül kapcsolódik az E2F-hez. A kollaborációs munka azt is felfedte, hogy a γ-tubulin komplexben azonosított stressz indukálta mitogén aktivált kináz (AtMPK6), a komplex egyik fehérjéjét foszforilálja, és stressz körülményekben szerepet játszik a normális sejtosztódás fenntartásában. Laboratóriumunk szakmai tapasztalata és pályázat anyagi támogatása lehetővé tette, hogy tovább nemzetközi kollaborációs munkákban vegyünk részt. Ezen munkák Peredményeként betekintést adhatunk a DNS károsodásra adott molekuláris válaszra, PINOID fehérjék auxin transzportban betöltött szerepébe, és leírtunk egy új növényi protein kináz szubsztrát azonosítási eljárást. A projekt időtartamában elvégzett munkák jelentőségét jelzi, hogy legtöbb eredményünk rangos tudományos folyóiratokban került publikálásra. Továbbá kiemelendő, hogy a pályázat keretében új hazai és nemzetközi együttműködéseket alakítottunk ki.
Results in English
In concert with the original proposal, the research partners implemented experiments to study putative function of γ-tubulin in cell cycle regulation via forming complex with E2F transcription factors. The obtained results confirmed the working hypothesis by demonstrating direct interaction E2F-γ-tubulin proteins and that DP and γ-tubulin competes for the same protein binding site of E2Fs. The collaborative work also revealed that the stress activated mitogen activated kinases, AtMPK6 interacts with γ-tubulin complex on specific subsets of mitotic microtubules during late mitosis, phosphorylates a protein of γ-tubulin complex, and has a role in maintaining regular planes of cell division under stress conditions. The expertise of our laboratory and financial support of grant provided an opportunity for taking part in further research collaborations with several national and international plant science laboratories. These cooperative works provided insight into DNA damage response, activity regulation of a plant specific mitogen activated kinase, role of PINOIDs in auxin transport, and resulted in development of a novel plant protein kinase substrate identification method. Most of the obtained results have been published in highly-ranked research periodicals illustrating significance of the research activities that were accomplished in the timeframe of grant support. A further important benefit of the implemented project is the establishment of new collaborations.
Kohoutova L, Kourova H, Nagy SK, Volc J, Halada P, Meszaros T, Meskiene I, Bogre L, Binarova P: The Arabidopsis mitogen-activated protein kinase 6 is associated with gamma-tubulin on microtubules, phosphorylates EB1c and maintains spindle orientation under nitrosative stress., NEW PHYTOL 207: (4) 1061-1074, 2015
Nagy SK, Darula Z, Kallai BM, Bogre L, Banhegyi G, Medzihradszky KF, Horvath GV, Meszaros T: Activation of AtMPK9 through autophosphorylation that makes it independent of the canonical MAPK cascades., BIOCHEM J 467: (1) 167-175, 2015
Dory M, Doleschall Z, Nagy SK, Ambrus H, Meszaros T, Barnabas B, Doczi R: Kinase-Associated Phosphoisoform Assay: a novel candidate-based method to detect specific kinase-substrate phosphorylation interactions in vivo., BMC PLANT BIOL 16: (1) , 2016
Ditengou FA, Gomes D, Nziengui H, Kochersperger P, Lasok H, Medeiros V, Paponov IA, Nagy SK, Nadai TV, Meszaros T, Barnabas B, Ditengou BI, Rapp K, Qi L, Li X, Becker C, Li C, Doczi R, Palme K: Characterization of auxin transporter PIN6 plasma membrane targeting reveals a function for PIN6 in plant bolting., NEW PHYTOL in press: x, 2017
Horvath BM, Kourova H, Nagy S, Nemeth E, Magyar Z, Papdi C, Ahmad Z, Sanchez-Perez GF, Perilli S, Blilou I, Pettkó-Szandtner A, Darula Z, Meszaros T, Binarova P, Bogre L, Scheres B: Arabidopsis RETINOBLASTOMA RELATED directly regulates DNA damage responses through functions beyond cell cycle control, EMBO J 36: (9) 1261-1278, 2017
Magdalena Dory, Elizabeth Hatzimasoura, Brigitta M Kállai, Szilvia K Nagy, Katalin Jäger, Zsuzsanna Darula, Tímea V Nádai, Tamás Mészáros, Enrique Lopez Juez, Beáta Barnabás, Klaus Palme, László Bögre, Franck A Ditengou, Róbert Dóczi: Coevolving MAPK and PID phosphosites indicate an ancient environmental control of PIN auxin transporters in land plants, FEBS LETT 592: (1) 89-102, 2018
