Molecular and functional characterization of genes controlling resistance to tomato spotted wilt virus and bacterial spot in pepper (Capsicum annuum L.).
A paradicsom bronzfoltosság vírus és baktériumos levélfoltosság ellen rezisztenciát biztosító gének azonosítása és molekuláris jellemzése paprikában.
Title in English
Molecular and functional characterization of genes controlling resistance to tomato spotted wilt virus and bacterial spot in pepper (Capsicum annuum L.).
Keywords in Hungarian
vírus és baktérium elleni rezisztencia, paprika, génklónozás
Keywords in English
resistance against virus and bacterial infection, pepper, gene cloning
Discipline
Plant biotechnology (Council of Complex Environmental Sciences)
70 %
Plant breeding (Council of Complex Environmental Sciences)
15 %
Plant pathology, molecular plant pathology (Council of Complex Environmental Sciences)
15 %
Panel
Plant and animal breeding
Department or equivalent
Agricultural Biotechnology Institute (ABC) (National Agricultural Research and Innovation Centre)
Participants
Domonkos, Ágota Szabó, Zoltán Tóth, Zoltán
Starting date
2015-01-01
Closing date
2019-12-31
Funding (in million HUF)
43.714
FTE (full time equivalent)
7.80
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. A projekt fő célja a paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt virus, TSWV) és a baktériumos levélfoltosságot okozó Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) baktériummal szemben ellenállóságot biztosító paprika CaTSW és Cabs6 génjeinek azonosítása, a korábban izolált paprika Cabs5 génjének és fehérje termékének további molekuláris szintű jellemzése. Egy korábbi projekt során azonosított genomi régió szekvenciájának TSW rezisztens szülőből történő meghatározást követően azonosítjuk a CaTSW gént. A Cabs6 gént térképezésen alapuló klónozással izoláljuk, majd genetikai komplementációs kísérletben igazoljuk, hogy valóban az izolált Cabs6 gén felelős az Xcv rezisztens fenotípus kialakításáért. A CaTSW és Cabs6 gének ismeretében specifikus molekuláris markerek tervezhetők, amelyek felhasználhatók multi-rezisztens paprika fajták nemesítése során. Célzott kísérleteket tervezünk a CaBs5 gén és fehérje termékének molekuláris és funkcionális jellemzésére. A kutatócsoportban korábban azonosított eddig ismeretlen funkciójú Cabs5 gén felelős az Xcv rezisztenciáért, amit komplementációs kísérletben igazoltunk. Szekvencia analízis alapján a Cabs5 egy sejtmembránhoz C-terminálisan kapcsolódó 92 aminosavat tartalmazó un. Tail Anchored fehérje. A molekuláris jellemzés során elvégezzük a (i) CaBs5/Cabs5 fehérjék kimutatását immunológiai technikával (Western blotting); (ii) a fehérjék sejten belüli lokalizációját konfokális mikroszkópiával; (iii) azonosítjuk a CaBs5 ortológjaival interakcióba lépő fehérje partnereket élesztő két-hibrid rendszerben. A fenti kísérletek új és lényeges eredményeket szolgáltatnak a gazda-patogén interakció molekuláris mechanizmusának megértéséhez.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. A tervezett kutatás célja annak megértése, hogy milyen molekuláris mechanizmuson keresztül játszódik le a Tomato spotted Wilt vírus (TSWV) és a Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) fertőzés, amelyek a paprika és a paradicsom legsúlyosabb betegségeit, a vírusos foltos hervadást és a baktériumos levélfoltosságot okozzák. A folyamat feltárásához először a folyamatban résztvevő és a rezisztenciát eredményező növényi géneket azonosítjuk, majd a gének fehérje termékeit jellemezzük, és ezt követően állítunk fel hipotézist a fehérjék, illetve a biológiai folyamat egyes lépéseire vonatkozón. A genetikai térképezésen alapuló génizolálás biztosítja azt, hogy az izolált Cabs5 és az izolálandó CaTSW és Cabs6 gének valóban részt vesznek a fertőzés biológiai folyamatában. A gének és termékeik molekuláris szintű jellemzése (szekvencia analízis, sejten belüli lokalizáció, kölcsönható fehérjék azonosítása) pedig lehetőséget teremt a fertőzési folyamat pontosabb molekuláris szintű megértéséhez. A rezisztens allél pontos DNS és aminosav szekvenciájának ismerete és vizsgálata rávilágít szerkezeti, evolúciós és funkcionális részletekre is. A kutatás egyik legizgalmasabb kérdése az, hogy a korábban izolált CaBs5 gén fehérje terméke hogyan akadályozza meg az Xcv baktérium fertőzőképességét, virulenciáját.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! Két fontos zöldség növényünk, a paprika és a paradicsom termesztése során a TSW vírus és a Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) baktérium okozza a legjelentősebb károkat. Míg a paprikában a természetben előforduló rezisztens gének segítségével Xcv baktériumnak ellenálló fajtákat lehetett nemesíteni, addig a paradicsomban ilyen gének nem állnak rendelkezésünkre, ezért az Xcv rezisztencia mechanizmusának megismerése paprikában a paradicsom szempontjából is nagy jelentőséggel bír. A nemesítésben a CaTSW és Cabs6 génekre specifikus molekuláris markerek kifejlesztése fontos célkitűzés (a Cabs5 génre nézve ez már megtörtént), mert ezeket a markereket a nemesítésben fel lehet használni. A markereken kívül a pályázatban tervezett kísérletek eredményei új információkkal szolgálnak majd a gazda-patogén interakció mechanizmusára vonatkozóan. Fontos cél a Cabs5 és Cabs6 fehérjék funkciójának feltárása. A különböző patogének (növényeknél pl. a Xanthomonas, Pseudomonas, Erwinia, állatoknál a Yersinia, Salmonella, Escherichia, Shigella fajok) a Hármas Típusú Szekréciós Rendszerük segítségével az eukarióta sejtek citoplazmájába átjuttatott effektor molekulákkal manipulálják a megfertőzött gazdaszervezeteket. Korábbi eredmények azt mutatják, hogy a Cabs5 fehérje megakadályozza az effektor molekulák célba jutását, ami magyarázza a rezisztencia kialakulását. A mutáns Cabs5 fehérje egy módosult farokvéggel rendelkező Tail Anchored fehérje. Előzetes konfokális mikroszkópos vizsgálatok alapján a Cabs5 fehérje kulcsszerepet játszik a gazdasejt membrán lipid szigeteinek kialakításában. Hipotézisünk az, hogy a patogén baktérium pilusa kapcsolódik egy feltételezett, gazdasejt külső felszínén található receptorhoz, és egy membrán platform (lipid sziget, membrán raft) közreműködésével biztosítja a bakteriális effektor molekulák bejutását a gazdasejt citoplazmájába. Ez a platform a mutáns Cabs5 jelenlétében nem alakul ki. A Cabs6 gén nukleotid szekvenciája és az abból levezethető aminosav sorrend fel fogja tárni ennek a rezisztens fehérje szerkezetét és választ ad ara a kérdésre, hogy a Cabs6 fehérje hasonló-e a Cabs5 fehérjéhez, vagy attól eltér, illetve, hogy ugyanabban a biológiai lépésben vesz-e részt.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. Az alacsony vegyszer-felhasználású környezetbarát növénytermesztés a modern mezőgazdaság egyik alapkövetelménye. Magyarországon ez az igény még fokozottabb, mivel a mérgező vegyszerek talajba jutásának gátlása biztosítja az egészséges táplálékot és a tiszta ivóvíz tartalékokat rövid és hosszú távon. A betegségek elleni védelemben az ellenálló fajták fontos szerepet játszanak, mert termesztésükkel a vegyszeres védekezés csökkenthető. A két legfontosabb zöldségnövényünk a paprika és a paradicsom termesztésében a patogén TSW vírus és a Xanthomonas (Xcv) bakterium okozza a legjelentősebb károkat. A paprika esetében a nem hiperszenzitív típusú reakciót és magas fokú, recesszív rezisztenciát biztosító bs5 és bs6 a legalkalmasabb ellenálló fajták nemesítésére. Korábbi kutatásaink során izoláltuk a bs5 gént és részben megismertük tulajdonságait. A bs6 gén megismerését ennek a pályázatnak a keretében tervezzük. A bs6 gén térképezésen alapuló izolálása lehetővé teszi - mint ahogy ezt megtettük a bs5 esetében is -, hogy a rezisztencia génekre genetikai markereket tervezzünk, melyek alkalmazásával a nemesítési idő csökkenthető és gazdaságosabbá tehető. Fontos célkitűzés számunkra a bs5 gén és fehérje termékének molekuláris és funkcionális jellemzése immunológiai, mikroszkópos és fehérje-fehérje kölcsönhatást vizsgáló módszerek alkalmazásával.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. The principal objective of this proposal is the identification of the pepper CaTSW and Cabs6 genes conditioning resistance to spot wilt caused by TSW virus and bacterial spot disease caused by Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv). The proposal also focuses on the characterization of the previously isolated Cabs5 gene and its protein product in more details. The genomic region containing the CaTSW gene was identified previously and we will attempt to clone the gene by analyzing the sequence determined from the resistant genetic background. Cabs6 gene will be isolated by map-based cloning and gene identity will be proved by genetic complementation. The sequence of the CaTSW and Cabs6 genes will allow us to design molecular markers for breeders to develop multi-resistant pepper varieties. Experiments will be carried out for the molecular and functional characterization of the CaBs5 gene and their protein product. The Cabs5 gene inherited in recessive way, encodes a protein with unknown function which is responsible for the Xcv resistance in pepper. Sequence analysis indicated that the protein product of Cabs5 composed of a 92 residues which anchored to the membrane by its C-terminal end (so called Tail Anchored protein). In order to understand the function of the Cabs5 we aim to detect CaBs5 and Cabs5 proteins by immunological approaches; to determine their subcellular localization by laser scanning confocal microscopy; to identify interacting partners of CaBs5 orthologs using yeast two-hybrid-system. These experiments will result in original findings which will contribute significantly to reveal the molecular mechanism of the host-pathogen interaction.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. The main objective of this proposal is to understand the molecular mechanism behind the infection evoked by tomato spot wilt virus (TSWV) and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv). TSWV and Xcv are the most harmful pathogens in pepper and tomato causing viral spot wilt and bacterial spot disease. To reveal the biological events, the genes controlling the resistance to these diseases will be isolated and the genes and their protein products will be characterized in details (sequence analysis, intracellular localization and identification of interacting partners). The characterization will allow us to better understand the molecular events between the pathogen and the host plant. The DNA protein sequence of the resistant alleles will reveal structural, evolutionary and functional details as well. Based on the features of the cloned genes hypotheses will be put forward regarding the function of the proteins and the mechanism of the resistance. One of the most intriguing questions is how the protein products of the previously isolated Cabs5 gene prevents the entry or the delivery of the effector molecules into the host cytoplasm and blocks the virulence of Xcv.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. In Hungary, the cultivation of pepper and tomato - the two most significant vegetables – endangered by infections of TSWV and Xcv which are causing the most serious damage of yield. In the case of pepper, natural occurring resistance genes were utilized to breed for resistant cultivars. However, until quite recently no such gene resources are available for tomato; therefore the understanding of the mechanism of Xcv resistance in pepper would help us to develop tomato cultivars resistant to bacterial spot disease. In the course of breeding, the elaboration and use of specific molecular markers for Cabs6 (for Cabs5 it has already been developed) is a primary objective, since these markers can be used in breeding. Experiments will be carried out to reveal the function of Cabs5 and Cabs6 genes and the analysis of their protein product may elucidate the mechanism of plant-pathogen interaction in wider context. Pathogens (like Xanthomonas, Pseudomonas, Erwinia for plants and Yersinia, Salmonella, Escherichia, Shigella for animals) use Type Three Secretion System to deliver effector molecules into the host cytoplasm to cause disease. Our previous results indicated that the mutant Cabs5 protein prevents the effector molecules to enter the host cytoplasm and therefore the plants became resistant to Xcv. Cabs5 is a Tailed Anchored protein with an altered C-terminal end. Preliminary confocal microscopy indicated that CaBs5 protein may be involved in the membrane lipid raft formation of the host cell. It may be hypothesized that the pili of the pathogen attach to a host receptor found on the surface of the host cell and the effectors proteins are transferred to the cytoplasm by the help of a membrane platform (lipid island, membrane raft). Different pathogens may use specific lipid islands to deliver effectors consequently different Tail Anchored proteins have similar function. The nucleotide and the deduced amino acid sequence of Cabs6 gene will reveal the structure of the CaBs6 protein and will allow us to answer whether Cabs6 functions in a similar way as Cabs5 and whether Cabs6 is involved in the same biological events.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. Environmentally friendly plant cultivation with limited use of chemicals is a demand of modern agriculture. Having a long lasting tradition of olericulture in Hungary, this requirement is even more significant because the prevention of the leakage of toxic chemicals into the soil ensures healthy food, feed and drinking water in the long run. Cultivating resistant plant varieties to prevent pathogen attacks is an important practice since the use of toxic chemicals can be reduced. Pepper and tomato - two of the most relevant vegetables in Hungary – production is endangered by several pathogens. The most detrimental damages are the viral spot wilt and the bacterial spot diseases caused by tomato spot wilt virus (TSWV) and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv). In pepper, two natural occurring non-hypersensitive type recessive resistance genes are available (bs5 and bs6) which were used to producer resistant pepper cultivars. During our previous work, bs5 has been isolated and partially characterized. The identification of bs6 is one of the objectives of this proposal. Map based cloning approach will be applied to clone bs6 and the developed molecular markers can be profitably used to breed pepper for bs6 resistance in the same way as we did for bs5. Moreover, molecular and functional characterization of the bs5 protein will be carried out using immunological methods, microscopical analysis and experiments to detect interacting proteins.
Final report
Results in Hungarian
A projekt fő célja a paradicsom bronzfoltosság (TSW) vírus és a baktériumos levélfoltosságot okozó Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) baktériummal szemben ellenállóságot biztosító paprika CaTSW és Cabs6 génjeinek azonosítása volt. A projekt során azonosítottuk a Tsw rezisztenciát biztosító gént tartalmazó genomi régiót genetikai térképezéssel. Az azonosított régióban számos nukleotidkötő és leucine-gazdag domént hordozó rezisztencia fehérje (NLR) génjeit azonosítottuk. Vizsgálatainkkal egy időben, hogy melyik NLR gén lehet felelős az TSW vírus elleni rezisztenciáért, egy koreai kutatócsoport azonosította és előttünk leközölte a Tsw gént. Olyan PCR-alapú genetikai markert fejlesztettünk, amelyet nagy hatékonysággal lehet alkalmazni marker alapú szelekcióra a paprika TSW vírus rezisztenci nemesítése során. Genetikai térképezéssel azonosítottuk az Xcv ellen recesszív rezisztenciát biztosító bs6 gén térképhelyét. Finomtérképezéssel tovább szűkített genomi szakaszról kiválasztottunk négy olyan gént, melyek jelöltek lehetnek a bs6 génre. A gén azonosságának bizonyítása jelenleg is folyik. Az Xcv fertőzés ellen ellenállóságot biztosító másik gén (bs5) funkcionális vizsgálata során bizonyítottuk, hogy a géntermék a plazmamembránon helyezkedik el. Xcv szenzitív (Bs5) és rezisztens (bs5) növények transzkripciós aktivitásának vizsgálatával számos olyan gént azonosítottunk, melyek a az Xcv elleni rezisztencia folyamatokban vehetnek részt.
Results in English
The principal objective of this proposal was the identification of the pepper CaTSW and Cabs6 genes conditioning resistance to spotted wilt caused by TSW virus and bacterial spot disease caused by Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv). The genomic regions of the Tsw gene conferring resistance TSW virus was identified with map-based cloning. The analysis of the genomic regions identified several nucleotide-binding and leucine-rich domain (NLRs) containg resistance genes. During the time of the functional analysis of the candidate NLRs, another group identified and published the TSW gene. We developed a PCR-based genetic marker closely linked to the Tsw gene and suitable for marker assisted selection (MAS). We identified the genomic region carrying the bs6 resistance locus to Xcv infection. We selected four candidate genes located in the identified region that might correspond to bs6. The confirmation of the gene identity is in progress. The functional analysis of another resistance gene, bs5 conferring resistance to Xcv revealed that the protein is localized on the plasma membrane. The transcriptional analysis between bs5 (resistant) and Bs5 (sensitive) pepper lines identified several differentially expressed genes predicted to be involved in plant defense responses and resistance processes.
L Hajnik, Z Szabó, A Jeney, Z Tóth, Á Domonkos, N Szabadi, G B. Kiss, P Kaló: Development of genetic markers linked to TSWV resistance for marker assisted selection in pepper., Proceedings of the XVI. EUCARPIA Capsicum and Eggplant Meeting. Kecskemét, 12-14. Sept. 2016 pages: 534-537 ISBN 978-615-5270-27-7, 2016
P Salamon, J Mitykó, P Kaló, Z Szabó: Symptoms caused by Tomato spotted wilt virus (TSVW) in pepper (Capsicum spp.) and marker assisted selection of TSWV resistant pepper lines for hybrid constructions., Proceedings of the XVI. EUCARPIA Capsicum and Eggplant Meeting. Kecskemét, 12-14. Sept. pages: 69-75. ISBN 978-615-5270-27-7, 2016
