Studying the effect of heterogeneous chemical environments on bacteria using microfluidic devices  Page description

Help  Print 
Back »
 

Details of project

  
Identifier
112509
Type PD
Principal investigator Nagy, Krisztina
Title in Hungarian Heterogén kémiai környezet baktériumokra való hatásának vizsgálata mikrofluidikai eszközökkel
Title in English Studying the effect of heterogeneous chemical environments on bacteria using microfluidic devices
Keywords in Hungarian bakteriális mozgás, kémiai gradiens, kemotaxis, mikrofluidika, antibiotikum rezisztencia, quorum érzékelés
Keywords in English bacterial motility, chemical gradients, chemotaxis, microfluidics, antibiotic resistance, quorum sensing
Discipline
Biophysics (e.g. transport mechanisms, bioenergetics, fluorescence) (Council of Medical and Biological Sciences)70 %
Ortelius classification: Physiological biophysics
Microbiology: virology, bacteriology, parasitology, mycology (Council of Medical and Biological Sciences)30 %
Panel Cellular and Developmental Biology
Department or equivalent Institute of Biophysics (HUN-REN Biological Research Centre Szeged)
Starting date 2014-10-01
Closing date 2017-09-30
Funding (in million HUF) 22.689
FTE (full time equivalent) 2.40
state closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
A baktériumok mozgásuk révén képesek heterogén környezetük feltérképezésére. Ahhoz hogy megértsük viselkedésüket, a mozgás és ezzel együtt a kémiai gradiensek vizsgálata szükséges. Laborunkban a hagyományos mikrobiológiai eljárásokat a mikrofluidika eszközeivel kiegészítve vizsgáljuk baktériumok úszását kémiai gradiensekben. Létrehoztunk egy speciálisan erre a célra tervezett eszközt, melyben a sejtek szabadon úszhatnak egy statikus, ám heterogén kémiai környezetben. Fluoreszcencia mikroszkópia segítségével populáció szinten meghatározható a baktériumok térbeli eloszlása, egyes sejtek szintjén pedig a mozgás pontos útvonala.
Vizsgáljuk a baktériumok sejt-sejt kommunikációjában (pl. quorum érzékelés) fontos szerepet betöltő jelmolekulák (homoszerin laktonok=HL) hatását P. aeruginosa és E. coli baktériumok úszására. Meghatározzuk, hogy a jelmolekula koncentráció gradiense miként befolyásolja a sejtek térbeli eloszlását és a quorum állapot kialakulását. A quorum érzékeléssel kapcsoltan termelt sziderofor molekulák kemoeffektor hatásait is vizsgáljuk.
Előzetes kísérleteink alapján (E. coli sejtek ampicilin gradiensben) az antibiotikumoknak is hatásuk van a baktériumok úszására. A jelenség részletesebb feltárásához antibiotikumok széles körét teszteljük kemoeffektor potenciáljuk és a mozgásra gyakorolt hatásuk szempontjából. Egyes sejteket illetve populációkat tanulmányozva megtudjuk, képesek-e a térbeli koncentrációváltozásokat követve elkerülni az antibiotikumok hatásait. Eredményeinket az antibiotikum rezisztencia kialakulása szempontjából is értelmezzük, amelyek olyan felhasználásokhoz vezethetnek, melyekkel alkalmunk nyílik beavatkozni a baktériumközösségek működésébe.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
A mikrobák természetes élőhelyei időbeni és térbeli heterogenitást mutatnak. Adott élőhelyen különböző baktérium populációk élhetnek egymás mellett, melyek befolyásolhatják egymást. A jelmolekulákkal történő sejt-sejt kommunikációnak (pl. quorum érzékelés) kivételes szerep tulajdonítható. Arra vonatkozóan, hogy a kommunikációs jelmolekulák milyen hatással vannak a baktériumok úszására/kemotaxisára meglehetősen kevés adat áll rendelkezésre az irodalomban annak ellenére, hogy a jelmolekulák kemoeffektorként való működése nagyban befolyásolhatja a kritikus sejtsűrűség kialakulását. Kutatásaink során jelmolekula koncentráció gradiensekkel vizsgáljuk a quorum érzékelés és az úszómozgás kapcsolatát, illetve a quorum állapot kialakulásának dinamikáját.
A gyógyászati jelentőség miatt igen fontos az antibiotikumok baktériumokra gyakorolt hatásának vizsgálata. Tervezzük annak feltárását, hogy miként befolyásolják az antibiotikumok az úszó baktériumokat. A közelmúlt eredményei arra utalnak, hogy a koncentráció gradiensnek és a baktériumok mozgásának fontos szerepe lehet az antibiotikum rezisztencia kialakulásában. E lehetőség egyértelmű kísérleti tisztázása még szükséges. Célunk annak tanulmányozása, hogyan reagálnak a baktériumok az antibiotikum gradiens jelenlétére, és a koncentráció térbeli eloszlása milyen hatással van a baktériumok eloszlására, illetve túlélési esélyére. Több antibiotikumot fogunk tesztelni, meghatározzuk azoknak az úszásra és a kemotaxisra gyakorolt hatását. Tanulmányozzuk az antibiotikumok lehetséges kemoeffektor szerepét. Adatainkat új, az antibiotikumok gyors evolúciójára vonatkozó eredmények fényében is elemezzük.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
Az elmúlt évben laborunkban létrehoztunk egy új típusú, mikrofluidikai eszközökre épülő kísérleti platformot, mely számos előnnyel bír a korábbi technológiákkal szemben: adott baktérium-populáció hosszú ideig megfigyelhető áramlásmentes környezetben, pontosan meghatározott kémiai koncentráció gradiensben. Az események sejt szinten és populáció szinten is nyomon követhetők. Nagyfokú érzékenysége révén ez a módszer értékes információkkal járulhat hozzá a hagyományos mikrobiológiai módszerekkel szerzett eddigi ismeretekhez, és egyszerűsége miatt széles körben elterjedhet.
Kutatásaink során a baktériumok sejt-sejt kommunikációját helyezzük előtérbe, azon belül is a quorum érzékelés és a mozgás kapcsolatát kívánjuk részletesebben feltárni. Ismert jelmolekulák (pl. HL-ek) baktériumok mozgására gyakorolt hatását vizsgáljuk P. aeruginosa (quorum érzékelés modellorganizmusa) törzseken. Tanulmányozzuk a quorum állapot kialakulásának HL koncentrációtól való függését, és baktériumok reakcióját kémiai gradiensekre. Kísérleteinkből értékes ismereteket nyerhetünk a quorum állapot bekapcsolásának dinamikájára vonatkozóan. E. coli sejtek nem képesek ugyan HL molekulák termelésére, de jelenlétét érzékelik. Vizsgáljuk ezeknek a sejteknek a mozgását is HL gradiens jelenlétében. Kísérleteink hasznosak lehetnek a több fajból álló baktériumközösségek kommunikációjának részletesebb megértéséhez is. A quorum érzékeléssel kapcsoltan termelt sziderofor molekulák kemoeffektor hatásait is vizsgáljuk. Ezek a molekulák (pl. pioverdin) a vasháztartás szabályozásán kívül jelmolekulaként is működnek, több virulencia faktor termelését szabályozzák A pioverdin hatásának részletesebb tanulmányozása fontos szerepet tölthet be a P. aeruginosa nagyfokú adaptációs képességének megértésében, és a bakteriális kommunikáció részletesebb megismerésében.
Antibiotikumok sejtmozgásra gyakorolt hatását tanulmányozva megtudhatjuk, milyen módszerekkel tudják a baktériumok az antibiotikumok hatásait elkerülni. Antibiotikum gradiensben követve a sejteket kiderítjük, hogy képesek-e a térbeli koncentrációváltozásokat érzékelni és követni. Az eredmények segítenek abban, hogy megmagyarázzuk az antibiotikum rezisztencia gyors evolúcióját heterogén körülmények esetén.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
A baktériumok számára fontos, hogy tájékozódni tudjanak egy összetett, bonyolult környezetben. Mozgásuk révén képesek feltérképezni merre találhatók a számukra kedvezőbb életkörülmények. Laborunkban a mikrotechnológia segítségével olyan jellemző mikrokörnyezeteket alakítunk ki, ahol a baktériumok számára fontos kémiai anyagok eloszlása térben egyenetlen. Olyan anyagok baktériumok mozgására gyakorolt hatását vizsgáljuk, melyek fontosak a természetes életközösségek életében is. Kiemelt szerep tulajdonítható a fajok közti és a fajon belüli kommunikációnak. A baktériumok által termelt kommunikációs jelmolekulák jelenléte/hiánya meghatározó lehet egy baktériumpopuláció működésére. Baktériumok számára sok esetben fontos lehet, hogy egymás jelenlétét érzékeljék. Megvizsgáljuk, képesek-e egymást „kiszagolni”, és társaik kémiai nyomdokait követni. Vajon hívják-e egymást a baktériumok? Összegyűlnek-e a hívószóra, vagy éppen elkerülik egymást? Vajon kémiai jelekkel hívják, vagy éppen elijesztik a más fajhoz tartozó baktériumokat? Munkánk ezekre a kérdésekre is segít válaszolni.
A baktériumok kommunikációján kívül tanulmányozzuk még, hogy a baktériumok hogyan reagálnak az antibiotikumok jelenlétére: megpróbálnak-e elúszni előlük, vagy pedig nem érzékelik ezeknek a vegyületeknek a jelenlétét környezetükben. Ennek feltérképezése különösen fontos, hiszen a gyógyászatban egyre nagyobb probléma a baktériumok antibiotikumokkal szembeni ellenállóképessége.
Úgy hisszük, kutatási eredményeink olyan (gyógyászati és egyéb) felhasználásokhoz is vezethetnek, melyekben a számunkra hasznos baktériumokat támogatjuk, miközben a káros baktériumokat elnyomjuk.
Summary
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
Motility helps bacteria to explore spatially heterogeneous environments, therefore motility and chemical gradients need to be studied to understand bacterial behavior. We combine classical microbial methods with the tools of microfluidics. We have fabricated a microfluidic device that creates temporally stable chemical gradients in a flow-free environment. On population level the spatial distribution of bacteria can be detected, while on single cell level the swimming trajectory can be determined by fluorescence microscopy.
We study the effect of signal molecules secreted by bacteria during cell-cell communication (e.g. quorum sensing) on the motility of P. aeruginosa and E. coli. Cells will be exposed to concentration gradients of homoserine lactones (HL), and the spatial distribution of bacteria along the gradient will be determined. The results will give us information about the chemotactic potential of these molecules and the dynamics of the onset of the quorum state. The secretion of siderofores is also connected with quorum sensing. Such molecules will also be tested as potential chemoeffectors.
Our preliminary experiments (E. coli in ampicilin gradient) suggest that antibiotic gradients induce a chemotactic response in E. coli. Hence we test a selection of antibiotics with different mode of action if they have effect on bacterial motility and chemotaxis. By tracking single cells and whole populations in such gradients we can find out whether or not bacteria are able to detect the spatial concentration changes of antibiotics, and avoid their effect. The results will help us to study and explain some aspects of the evolution of antibiotic resistance.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
Heterogeneity is a typical characteristics of natural environments where microbes live. Populations of different bacterial species live together, influencing each other. Signalling molecules, as part of the cell-cell communication system (e.g. homoserine lactones in quorum sensing) have key role in such communities. Even though these molecules as potential chemoeffectors can have a high impact on the formation of critical cell number (that is needed for the quorum), only less information can be found about their effect on bacterial motility and chemotaxis in the literature. We plan to study the relation of quorum sensing with the swimming behaviour of bacteria by generating concentration gradients of signal molecules. These experiments will also give us information about the dynamics of the onset of quorum state.
Studying the effect of antibiotics on bacteria is of upmost importance because of its medical relevance. A recent experimental publication based on microfluidics, as well as some theoretical modelling works suggest that concentration gradients and motility have a crucial role in the evolution of antibiotic resistance, however experimental proofs are needed. Our experiments will reveal how such gradients affect the motility and spatial distribution of bacteria. We plan to test a great variety of antibiotics whether or not they have an impact on bacterial motility (swimming speed) and/or induce chemotactic response in bacteria. The results will help to explain the observations of fast evolution of resistance, and will be the foundation of future evolutionary experiments.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
Recently we have developed a microfluidic device to generate chemical gradients. The use of our device offers several advantages comparing to other methods: completely eliminates flow, and cells may be studied for an extended period of time in a well-controlled chemical environment. Single cells and populations can be tracked as well. Because of its high sensitivity this platform enables us to address a wide spectrum of fundamental biological problems that were challenging to study previously.
Bacterial cell-cell communication is in the focus of our interest. We try to reveal details of the relation between quorum sensing and bacterial motility. For this purpose P. aeruginosa (modelorganism of quorum sensing) will be exposed to gradients of well-known signal molecules (HLs). We will also investigate if there is any concentration dependent effect of HL on the quorum. Results will deepen our knowledge about the dynamics of the onset of the quorum. We also plan to study the motion of E. coli in such gradients, since that species is not able to secrete, but can sense the presence of HLs. There is no information in the literature about how E. coli behaves in such an environment. Our experiments can be useful to better understand the communication of communities where different species live together.
Siderophore molecules (e.g. pyoverdin) as potential chemoeffectors will be studied as well. These molecules are responsible for the iron homeostasis of certain bacteria and can also act as signal molecules, regulating the secretion of virulence factors. Pioverdin secretion is regulated by quorum sensing. To study the effect of its gradient can lead us to better understand the high adaptation ability of P. aeruginosa, and the bacterial communication.
The effect of antibiotics on the swimming behaviour of bacteria will be also investigated. By tracking the cells (using fluorescence microscopy) in different antibiotic gradients, we reveal if bacteria can sense the spatial concentration changes and avoid the harmful effect of antibiotics. The result of our systematic studies of cellular motility/chemotaxis in antibiotic gradients can help us to understand the mechanisms behind fast evolution of antibiotic resistance.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
Orientation in a complex heterogeneous environment is really important for bacteria. They can find the optimal living conditions (e.g. nutrient sources) and places by swimming around. In our laboratory we use microtechnology to create such microenvironments where the distribution of important chemical compounds is spatially heterogeneous. We study the effect of chemical compounds that are also relevant in the life of natural bacterial communities on motile bacterial.
The inter- and intraspecies communication has a special role in the life of a community, thus the presence/absence of communicational signal molecules has a great impact on a bacterial population. Within certain conditions (e.g. infections) a population may profit a lot if the cells are able to sense each other. We study whether bacteria are able to detect and follow the chemical path of other bacteria. Do bacteria call each other? Do they gather for the call or do they try to avoid each other? Do they call bacteria of other species by chemical signals or do they frighten away others? Our experiments may help to answer these questions.
Besides bacterial communication, we study the reaction of bacteria to antibiotic gradients: whether they try to swim away from the high concentrations or they don’t even sense the presence of these compounds. This seems particularly important if we consider that the emergence of antibiotic resistance is a crucial problem in therapeutics.
We believe that our results may lead to such (medical and other) applications that are based on supporting the beneficial, while suppressing the harmful bacteria.




 

Final report

  
Results in Hungarian
Kommunikációs jelmolekulák és antibiotikumok baktréiumokra kifejtett hatását vizsgáltuk. - Kimutattuk, hogy P. aeruginosa quorum érzékelésében fontos kommunikációs jelmolekulái és másodlagos anyagcsertermékei kemotaxis választ indukálnak E. coli baktériumokban. - Kimutattuk, hogy bizonyos antibiotikumok befolyásolják a baktériumok úszó mozgását: 1) Baktériumok mozgása lelassul magas antibiotikum koncentráció jelenlétében. 2) E.coli baktériumok speciális térbeli eloszlást alakítanak ki ampicillin és ciprofloxacin gradiensekben. A jelenség kialakulásában szerepe van a bakteriális kemotaxisnak is. - Kimutattuk, hogy meghatározott körülmények között az antibiotikum gradiensek jelenléte felgyorsíthatja az antibiotikum rezisztencia kialakulását. - Antimikrobiális peptidek hatásárára bekövetkező változásokat figyeltünk meg a bakteriális sejtfal és sejtmembrán szerkezetében. Az általunk kimutatott membrán potenciál csökkenés feltehetően fontos része a peptidek aktivitásának. - Létrehoztunk egy mikrofluidikai cellát, melyben baktériumok növekedése és viselkedése vizsgálható áramlásos környezetben. Kimutattuk hogy az áramlás jelenléte befolyásolja P. aeruginosa quorum érzékelésének bekapcsolási dinamikáját. Sejtszintű variabilitást figyeltünk meg a jelenségben. A projekt során többféle mikrofluidikai eszközt is kifejlesztettünk: áramlási elektrokémiai cellát, kémiai koncentráció gradienseket előállító eszközöket és agyi kapilláris dinamikus modelljéül szolgáló eszközt.
Results in English
We studied the effect of communication signal molecules and antibiotics on bacteria. - We revealed the chemoeffector potential of quorum sensing signal molecules and secondary metabolites (pyocyanin and pyoverdine) of P. aeruginosa on E.coli. - We demonstrated that certain antibiotics have significant effect on the swimming behaviour of bacteria: 1) Bacteria slow down at high concentrations of antibiotics. 2) E.coli show a special spatial distribution pattern in response to gradients of ampicillin and ciprofloxacin. We have also proved that chemotaxis plays a role in this behaviour. - We have shown that in certain conditions the presence of antibiotic gradients can dramatically speed up the evolution of resistance. - We explored changes in the bacterial cell wall structure of bacteria upon antimicrobial peptide treatment. We have shown that small cationic antimicrobial peptides cause damage in the membranes resulting in the loss of membrane potential that could be the primary reason of their antimicrobial activity. - We developed a microfluidic system to study the effect of medium flow on bacterial growth and behaviour. We have shown that flow influence the dynamics of quorum sensing in P. aerugionosa. We have revealed cell-to-cell variability in this phenomenon. During the project we have developed several microfluidic devices: electrochemical flow-cells, chemical concentration gradient generators and dynamic brain capillary models.
Full text https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=112509
Decision
Yes





 

List of publications

  
József Balog: The effect of antibiotics on the swimming motility of bacteria, University of Szeged, Faculty of Science and Informatics, BSc diploma work, 2014
Renáta Elek: Designing hydrogel-based microchip for chemical gradient generation, University of Szeged, Faculty of Science and Informatics, BSc diploma work, 2014
K. Nagy, K. R. Mikuláss, A. G. Végh, A. Kereszt, É. Kondorosi, G. Váró, Z. Szeglezes: Interaction of cysteine-rich cationic antmicrobial peptides with intact bacteria and model membranes, General Physiology and Biophysics, 34: 135-144., 2015
K. Nagy, O. Sipos, S. Valkai, É. Gombai, O. Hodula, Á. Kerényi, P. Ormos, P. Galajda: Microfluidic study of the chemotactic response of Escherichia coli to amino acids, signaling molecules and secondary metabolites, Biomicrofluidics, 9: 044105., 2015
K. Nagy, K. R. Mikuláss, A. G. Végh, A. Kereszt, É. Kondorosi, G. Váró, Z. Szegletes: Interaction of cysteine-rich cationic antmicrobial peptides with intact bacteria and model membranes, General Physiology and Biophysics, 34: 135-144., 2015
K. Nagy, O. Sipos, S. Valkai, É. Gombai, O. Hodula, Á. Kerényi, P. Ormos, P. Galajda: Microfluidic study of the chemotactic response of Escherichia coli to amino acids, signaling molecules and secondary metabolites, Biomicrofluidics, 9: 044105., 2015
J. Molnar, C. Fazakas, J. Hasko, O. Sipos, K. Nagy, A. Nyul-Toth, A. E. Farkas, A. G. Vegh, G. Varo, P. Galajda, I. A. Krizbai, I. Wilhelm: Transmigration characteristics of breast cancer and melanoma cells through the brain endothelium: role of Rac and PI3K, CELL ADHESION & MIGRATION 10:(3) pp. 269-281., 2016
K. R. Mikulass, K. Nagy, B. Bogos, Z. Szegletes, E. Kovacs, A. Farkas, G. Varo, E. Kondorosi, A. Kereszt: Antimicrobial nodule-specific cysteine-rich peptides disturb the integrity of bacterial outer and inner membranes and cause loss of membrane potential, ANNALS OF CLINICAL MICROBIOLOGY AND ANTIMICROBIALS 15:(1) p. 43., 2016
K. Nagy, O. Sipos, S. Valkai, É. Gombai, O. Hodula, Á. Kerényi, P. Ormos, P. Galajda: Microfluidic study of the chemotactic response of Escherichia coli to amino acids, signaling molecules and secondary metabolites, Biomicrofluidics, 9: 044105., 2015
Orsolya Sipos: Studying physical and biochemical interactions in bacterial communities using microfabricated devices, University of Szeged, Faculty of Medicine, PhD Thesis, 2015
Barbara Dukic: The effect of antibiotic concentration gradients on Escherichia coli bacteria, University of Szeged, Faculty of Science and Informatics, BSc diploma work, 2015
Vanda Zsiros: Studying the dynamics of quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa bacteria, University of Szeged, Faculty of Science and Informatics, BSc diploma work, 2015
K. R. Mikulass, K. Nagy, B. Bogos, Z. Szegletes, E. Kovacs, A. Farkas, G. Varo, E. Kondorosi, A. Kereszt: Antimicrobial nodule-specific cysteine-rich peptides disturb the integrity of bacterial outer and inner membranes and cause loss of membrane potential, ANNALS OF CLINICAL MICROBIOLOGY AND ANTIMICROBIALS 15:(1) p. 43., 2016
K. Nagy, V. Zsiros, E. Csákvári, O. Hodula, P. Galajda: The dynamics of onset of AHL-mediated quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa, European Biophysical Journal with Biophysics Letters,46. Suppl. 1. S378, P-1001., 2017
T. Szabó, R. Csekő, K. Hajdú, K. Nagy, O. Sipos, P. Galajda, G. Garab, L. Nagy: Sensing photosynthetic herbicides in electrochemical flow cell, Photosynthesys Research, 132: 127-134., 2017
Á. Nyúl-Tóth, M.Kozma, P. Nagyőszi, K. Nagy, C. Fazakas, J. Haskó, K. Molnár, A. E. Farkas, A. G. Végh, G. Váró, P. Galajda, I. Wilhelm, I. A. Krizbai: Expression of pattern recognition receptors and activation of the non-canonical inflammasome pathway in brain pericytes, Brain Behaviour and Immunity, 64. 220-231., 2017
K. Nagy, Á. Ábrahám, P. Galajda: Application of microfluidics to microbial ecology: the importance of being spatial, Frontier in Microbiology, submitted, 2017



Back »