Molecular Mechanisms Underlying the Function of Myosin 16b  Page description

Help  Print 
Back »
 

Details of project

  
Identifier
112794
Type K
Principal investigator Nyitrai, Miklós
Title in Hungarian A miozin 16b funckiójának molekuláris mechanizmusai
Title in English Molecular Mechanisms Underlying the Function of Myosin 16b
Keywords in Hungarian fehérje, miozin, aktin, spektroszkópia, mikroszkópia, gyors-kinetika
Keywords in English protein, myosin, actin, spectroscopy, microscopy, rapid kinetics
Discipline
Molecular biology (Council of Medical and Biological Sciences)50 %
Ortelius classification: Molecular design, de novo design
Biophysics (e.g. transport mechanisms, bioenergetics, fluorescence) (Council of Medical and Biological Sciences)30 %
Ortelius classification: Molecular biophysics
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)20 %
Ortelius classification: Enzimology
Panel Molecular and Structural Biology and Biochemistry
Department or equivalent Institute of Biophysics (University of Pécs)
Participants Barkó, Szilvia
Bódis, Emoke
Bugyi, Beáta
Kengyel, András
Lukács, András
Tóth, Mónika
Varnyuné Kis-Bicskei, Nikolett
Starting date 2015-01-01
Closing date 2019-06-30
Funding (in million HUF) 34.992
FTE (full time equivalent) 7.18
state closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
A miozin 16b fehérje, speciális szerkezeti elemein keresztül, kulcsszerepet játszhat az idegsejtek fejlődésében, a sejtciklus szabályozásában, illetve a sejtváz organizációjában. Kutatásaink célja az ezen funkciók hátterében álló biokémiai és struktúrális tulajdonságok leírása, a vonatkozó molekuláris mechanizmusok megértése.
Kutatásunk során rekombináns technikával előállított miozin 16b fehérjét, illetve annak funkcionális egységeit kívánjuk vizsgálni in vitro körülmények között. Előkísérleteinkben a miozin 16b ankyrin doménjét sikeresen és megfelelő mennyiségben előállítottuk, ezért a kutatások első szakaszában ennek a funkcionális egységnek a megismerése lesz a célunk. Szintén skeresen expresszáltuk a miozin 16b motor doménjét, ebben az esetben a tisztítási folyamat optimalizálása lesz az első feladatunk.
Célunk a miozin 16b fragmentumok részletesen jellemzése biokémiai, biofizikai, spektroszkópiai módszerekkel, sejten belüli elhelyezkedésük feltérképezése (konvencionális, több-foton, TIRF és szuper felbontású fluoreszcencia mikroszkópiával) valamint szerkezetvizsgálatuk (röntgen krisztallográfiával), amivel magyarázatot adhatunk a fehérje sejtben betöltött szerepére. A kölcsönhatások vizsgálata más fehérjékkel (pl. PP1c, profilin) alátámaszthatja a miozin 16b feltételezett központi szerepét a sejtmagon belüli komplex regulációs folyamatokban. A molekuláris mechanizmusok, interakciók leírása közelebb vihet minket a neuronális fejlődési folyamatok és azok zavarainak megértéséhez.
Mindezek alapján úgy gondoljuk, hogy túl az alapkutatási megfigyeléseken eredményeink a későbbiekben a vonatkozó humán betegségek felismerésében és gyógyításában is szerepet kaphatnak.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
A kutatásaink célja a miozin 16b motorfehérje működésének és kölcsönhatásainak a megismerése. Vizsgálni szeretnénk ezen motor fehérje biokémiai tulajdonságait, szerkezetét, valamint kölcsönhatásait más partnerfehérjékkel, amelyekkel a korábban már leírt lehetséges funkciókra szeretnénk molekuláris szintű magyarázatot adni.
Feltételezésünk szerint a miozin 16b központi szerepet tölt be a az intracelluláris szabályozásban, amelynek elemei: az N-terminális ankyrin doménen keresztüli részvétel a defoszforilációs folyamatokban, illetve a C-terminális farok domén kapcsolata az aktin citoszkeletonhoz.
A következő specifikus kérdéseket kívánjuk megválaszolni:
Mi a szerepe a -miozinok között eddig egyedülálló módon itt megjelenő- ankyrin doménnek a motor funkció szabályozásában és a defoszforilációs folyamatokban? Milyen szerkezet jellemzi ezt a domént, és ez hogyan módosul a PP1c kötését követően?
Milyen kinetikai paraméterekkel jellemezhető a miozin 16b motor doménje, illetve a teljes hosszúságú miozin 16b?
Milyen szabályozási vagy egyéb szerepet tölt be a miozin 16b farki doménje? Hogyan vesz részt ez a fehérje szakasz a más fehérjékkel kialakított kölcsönhatásokban?
Mi a defoszforilációs targetje a miozin 16b-ből és PP1c-ből álló foszfatáz komplexnek?
Hol helyezkedik el a miozin 16b az élő sejtben, és milyen sejtfunkciókhoz kapcsolható a működése?

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
A miozin fehérjék több, mint 30, motor aktivitással rendelkező, de egyéb tulajdonágaiban jelentősen eltérő miozin családra oszthatók. Ezek közül korábban már számos miozin típus tulajdonságait leírták és a részletes biokémiai, szerkezeti és orvosbiológiai vizsgálatok rávilágítottak arra, hogy a különböző miozinok meghatározó életfunkciókban vesznek részt. Hibás működésük számos esetben a sejtek diszfunkciójához, pusztulásához, és ezeken a folyamatokon keresztül humán betegségek kialakulásához is vezetett. A miozin szupercsalád tagjai közül a miozin 16 családról még viszonylag keveset tudunk. Korábbi publikációkból ismert, hogy legnagyobb mennyiségben a fejlődő idegsejtekben fordulnak elő és leginkább a sejtmagban találhatóak meg, ahol részt vesznek a sejtciklus szabályozásában. Saját előkísérleteink arra is rávilágítottak, hogy kölcsönhatásaik révén fontos szerepet tölthetnek be a foszforilációs szabályozási útvonalak alakításában is.
Kutatásaink során ennek a még kevéssé ismert, de vélhetően számos fontos biológiai funkcióban szerepet játszó mizoin családnak a pontosabb megismerése lesz a célunk. A miozin 16b tanulmányozása során izoláltan vizsgálni fogjuk a funkcionálisan aktív fehérje doméneket: az ankyrin domént, a motor domént és a C-terminális farki domént, valamint a teljes hosszúságú miozin 16b-t is. Eredményeink meg fogják mutatni, hogy milyen funkcionális tulajdonságokkal rendelkezik ez a miozin, milyen kölcsönható fehérje partnereken keresztül fejti ki hatását, és hogy a működése során milyen szerkezeti átalakulások mennek végbe.
Mindezek egyfelől közelebb visznek majd minket a miozin 16b sejtekbenen és szövetekben, elsősorban a fejlődő idegsejtekben betöltött szerepének a megértéséhez, és további biotechnológiai alkalmazások kidolgozását is lehetővé teszik majd. Eredményeink ugyancsak fontos információval szolgálhatnak majd a vonatkozó humán betegségek diagnózisának és kezelésének a hatékonyabb és pontosabb kidolgozásához is. A sejtciklus szabályozásában betöltött funkciója ráirányithatja a figyelmet a miozin 16b lehetséges szerepére a tumorgenezisben, amely későbbi kutatások tárgya lehet majd.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
A biológiai rendszerek alapvető építő egységei a fehérjék, amelyek egyik speciális csoportja, az ún. motor fehérjék, amelyek képesek a kémiai energiát mechanikai munkává alakítani. Ezen parányi molekuláris motorok meghatározó szerepet töltenek be számos fontos sejtbiológiai folyamatban, például mozgásban, transzportban, rögzítésben. Meghibásodásuk, hiányuk vagy felszaporodásuk a sejtek elégtelen működéséhez, ezáltal betegségek vagy fejlődési rendellenességek kialakulásához vezet. Ennek megfelelően a biológiai kutatások egy izgalmas és nagyon gyorsan fejlődő ága arra szakosodott, hogy ezen parányi fehérje motorok működését megértse, kölcsönható partnereiket megismerje.
A tervezett vizsgálatainkban egy eddig még gyakorlatilag ismeretlen tulajdonságokkal rendelkező motor fehérje, a miozin 16b működését és szabályozását szeretnénk feltérképezni. Ehhez egyfelől a miozin 16b fehérjét, illetve annak funkcionális alegységeit fogjuk előállítanunk, másfelől számos biokémiai, biofizikai és más interdiszciplináris kutatási módszereket alkalmazva próbáljuk feltérképezni ezen fehérje szerkezetét, szabáyozását, élettani szerepét. Ismert, hogy a miozin 16b fehérje legnagyobb mennyiségben a fejlődő idegsejtekben fordul elő, ezért várható eredményeink elsősorban az idegrendszeri kórképek megértéséhez adhat támpontokat. Tekintve, hogy az eddigi szerény tudásunk erről a miozinról azt mutatja, hogy mind a sejtek foszforiláció alapú szabályozásában, mind a sejtmagok szerveződésében és működésében meghatározó – bár eddig meg nem értett – szerepet játszhatnak, kutatásaink várhatóan fontos és a későbbi orvosi alkalmazásokban is hasznos információval szolgálnak majd.
Summary
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
Through its special structure elements, myosin 16b plays a crucial role in the neuronal development, cell cycle regulation and the organization of the cytoskeleton. The aim of our research is to describe the biochemical and structural features responsible for the function of myosin 16b and to understand the related molecular mechanisms.
We plan to examine the recombinant myosin 16b motor protein and its functionally active domains in vitro. We already expressed and purified the ankyrin domain of myosin 16b and already expressed the motor domain. In the first period of this project we will characterize the isolated ankyrin domain and optimize the purification protocol for the motor domain.
The main goal of the project is the detailed characterization of the myosin 16b fragments from biochemical, biophysical, spectroscopic aspects, to follow their intracellular localization (with conventional, multi-photon, TIRF and super-resolution microscopy) and determine its molecular structure (with X-ray crystallography) finally to understand its intracellular function. Examining the interactions with other partner proteins (eg. profilin and PP1c) would strengthen the hypothesis about the suggested central role of the myosin 16b in the complex regulatory mechanisms inside the nucleus. Describing the molecular mechanisms, interactions of myosin 16b, might help us to understand the developing processes or disorders of the neurons.
By answering the proposed specific questions, we estimate that beside of the relevance as a basic research, our results will improve the knowledge about the related human diseases and may help in developing future diagnostic or therapeutic methods.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
The aim of the proposed project is to describe the coupling between the structural and functional properties of myosin16b. We plan to investigate its biochemical features, molecule structure and the interactions with other proteins, finally to elucidate the basics of the earlier described functions on the molecular level.
We hypothesise a central role for myosin 16b in the intracellular regulation, because through the N-terminal ankyrin domain it plays a role in the dephosphorylation process, while the C-terminal tail domain connects the actin cytoskeleton.
The specific questions addressed during the project are the following:

• What is the function of the ankyrin domain of myosin 16b – which is unique amongst myosins – in the regulation and dephosphorylation process? What is the 3D atomic structure of the ankyrin domain and when it is in complex with PP1c?
• What are the kinetic and structural properties determining the function of the motor domain of mosin16b and the full length myosin 16b?
• What roles does the C-terminal tail region of myosin 16b play in its regulation, and in the interactions with other protein?
• What is the dephosphorylation target of the myosin 16b/PP1c phosphatase complex?
• What is the cellular localization and function of these myosin 16b parts in living cells?

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
The myosin superfamily can be divided into more than 30 classes of myosins, where the similarity is the motor activity, while other features are highly divergent. Several myosin classes have been previously described and the detailed biochemical, structural and biomedical examinations pointed out the essential role of myosins. Dysfunctions of myosins lead to severe cellular abnormality, cell death and finally to the developement of human diseases. Beside several well characterized myosins, little is known about the class XVI myosins. Recent publications demonstrated, that myosin 16b accumulate in developing neurons and can be found in the nucleus, where it participate in the cell cycle regulation. Our preliminary data revealed an important role of myosin 16b in the regulation of the phosphorylation pathways, through its interaction with PP1c.
Our research is focusing on the characterization of this lesser-known myosin class, which is supposed to play important role in the cellbiological processes. In the proposed project, we will investigate both the isolated functionally active domains: such as the ankyrin domain, the motor domain and the tail domain, and the full length myosin 16b. The expected results will provide information regarding the details of the molecular mechanisms underlying the functional activity of myosin 16b, the interactions with the binding partners and the changes in the molecule structure during its function.
Based on these information we will have a much better understanding of the myosin 16b function in living cells and tissues, and will provide the opportunity to work out novel applications in biotechnology. The data are also expected to serve as a good basis in design and manifestation of future medical applications related to the corresponding human diseases. The role of myosin 16b in the regulation of cell cycle suppose a possible role in tumorgenesis and this might be another reserch direction in the future.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
The proteins are the basic building blocks of biological systems. Within the proteins there is a special group, called motor proteins, which can transform the chemical energy to mechanical work. These tiny little motors play essential roles in a number of biological functions such as in motions, transport or anchoring. Their inappropriate work, their shortage or accumulation lead to inadequate cellular functions and eventually to human diseases or developmental disorders. Accordingly, nowadays an exciting and rapidly growing field of biological research is focusing on the understanding of the biological work and regulation of these motor proteins. In the proposed investigations we aim to understand the functions and interactions of one of these motor proteins, the lesser-known myosin 16b. To understand its structure, regulation and physiological role, we will express and purify the myosin 16b and its functionally active fragments, and apply various biochemical, biophysical and other interdisciplinary methods. It is already described, that myosin 16b appears mostly in developing nerve cells, therefore our proposed result supposed to help understanding neurological disorders. Based on the little we know about this myosin it seems to be evident that it has an important role in the phosphorylation machinery of the cells, and also in the organization of the cell nuclei. We expect that our investigations will provide information regarding the function of myosin 16b, and the results eventually could also serve as excellent basis for the improvement of the corresponding medical applications.




 

Final report

  
Results in Hungarian
Kutatásunk célja a miozin 16 motorfehérje szerkezetének, kinetikájának, interakcióinak és szabályozásának a megismerése volt in vitro körülmények között, izolált rendszerben. Ehhez az N-terminális ankyrin domént, valamint a C-terminális farok domént klónoztuk, expresszáltuk és kidolgoztunk protokollokat a sikeres tisztításukhoz. Az ankyrin domén szerepét a motor funkcióra modell rendszerben vizsgáltuk vázizom és nemizom miozin 2 motor fehérjék felhasználásával. Kimutattuk, hogy az ankyrin domén képes kötődni a motor doménhez és fokozza annak aktin-aktivált ATPáz aktivitását, feltehetőleg az ADP kibocsátás kinetikai lépésének gyorsításán keresztül, ezáltal fontos szerepe lehet a motorfunkció szabályozásában. Szintén igazoltuk és pontosítottuk azt korábbi feltételezést, hogy az ankyrin domén nagy affinitással kötődik a protein foszfatáz katalítikus alegységekhez, viszont csökkenti azok defoszforilációs aktivitását, ezáltal feltehetőleg ezen fehérjék transzportjában játszhat szerepet. Különböző spektroszkópiai módszerekkel karakterizáltuk a miozin 16 farok domén rendezetlen szerkezetét, valamint kimutattuk kötődését az N-terminális ankyrin doménhez. Eredményeink alapján valószínűsíthető, hogy az ankyrin domén a visszahajló farok doménnel kapcsolódva részt vehet egy a funkció szempontjából fontos, kompakt molekulaszerkezet kialakításában. Eredményeink hozzájárulhatnak a miozin 16 alaposabb megismeréséhez, ezáltal az élettani folyamatokban betöltött szerepének tisztázásához.
Results in English
The aim of the project was to describe the structure, kinetics, interactions and regulation of the myosin 16 motor protein in vivo, in isolated systems. Primarily, we cloned and expressed the N-terminal ankyrin domain and the C-terminal tail domain and we developed protocols for the succesful purification. The role of the ankyrin domain was observed in model systems, where we used skeletal- and non-muscle myosin 2 motor proteins. We revealed, that the ankyrin domain binds to the motor domain and enhance the actin-activated ATPase activity, possibly, through the increase of the ADP-release in the kinetic cycle, thus it can play an important role in the regulation of the motor function. We also confirmed and clarified the previous assumption, that the ankyrin domain strongly binds to the protein phosphatase catalytic subunits, but it decreases the dephosphorylation activity, thus it may participate more likely in the transportation of these proteins. We characterized the intrinsically disordered structure of the tail domain using different spectroscopic techniques and we also described an interaction to the N-terminal ankyrin domain. We suppose, that the backfolding of tail domain to the ankyrin domain may participate in the formation of a functionally important compact conformation. Our results contribute to the better understanding of myosin 16, and helps to clarify its role in the physiological processes.
Full text https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=112794
Decision
Yes





 

List of publications

  
Kengyel A, Bécsi B, Kónya Z, Sellers JR, Erdődi F, Nyitrai M.: Ankyrin domain of myosin 16 influences motor function and decreases protein phosphatase catalytic activity., Eur Biophys J. 44(4): 207–18, 2015
Czimbalek L, Kollár V, Kardos R, Lőrinczy D, Nyitrai M, Hild G: The effect of toxofilin on the structure and dynamics of monomeric actin, FEBS Lett. 589(20 Pt B):3085-9., 2015
Türmer K, Orbán J, Gróf P, Nyitrai M: FASCIN and alpha-actinin can regulate the conformation of actin filaments, Biochim Biophys Acta, General Subjects. 1850(9):1855-61, 2015
Veronika Takács-Kollár, Miklós Nyitrai, Gábor Hild: The effect of mouse twinfilin-1 on the structure and dynamics of monomeric actin, BBA – Proteins and Proteomics, 1864(7):840-, 2016
Szilvia Barkó, Dávid Szatmári, Emőke Bódis, Katalin Türmer, Zoltán Ujfalusi, David Popp, Robert C. Robinson, Miklós Nyitrai: Large-scale purification and in vitro characterization of the assembly of MreB from Leptospira interrogans, BBA – General subjects, 2016
Anikó Osteikoetxea-Molnár, Edina Szabó-Meleg, Eszter Angéla Tóth, Ádám Oszvald, Emese Izsépi, Mariann Kremlitzka, Beáta Biri, László Nyitray, Tamás Bozó, Péter Németh, Miklós Kellermayer, Miklós Nyitrai, János Matkó: The growth determinants and transport properties of tunneling nanotube networks between B lymphocyte, Cellular and Molecular Life Sciences, 73(23):4531-4545, 2016
Veronika Takács-Kollár, Miklós Nyitrai, Gábor Hild: Spectroscopic characterization of the effect of mouse twinfilin-1 on actin filaments at different pH values, J. Photochem. Photobiol. B, 164:276-282, 2016
Kengyel, A., Telek, E., Kónya, Z., Bécsi, B., Erdődi, F. Nyitrai, M.: Interactions and Functions of Myosin 16 Domains, Biophysical Journal, Vol. 112, Issue 3, p267a, 2017
Telek, E., Kengyel, A., Nyitrai, M.: Interactions and Functions of the C-terminal Domain of Myosin 16, MBFT XXVI. Congress, Szeged, Hungary, Aug. 22–25, 2017
Holló A., Vékony Zs., Kengyel, A., Nyitrai, M.: The Effect of Myosin 16 Ankyrin domain on the actomyosin system, MBFT XXVI. Congress, Szeged, Hungary, Aug. 22–25, 2017
Kengyel, A., Telek, E., Kónya, Z., Bécsi, B., Erdődi, F. Nyitrai, M.: Interactions and Functions of Myosin 16 Domains, The 32th European Cytoskeletal Forum Meeting, Helsinki, Finland, Jun. 4 – 8, 2017
Kengyel, A., Telek, E., Kónya, Z., Bécsi, B., Erdődi, F. Nyitrai, M.: Biochemical Characterization of Myosin 16 Domains, Hungarian Molecular Life Sciences, Eger, Hungary, Marc. 30. – Apr. 2, 2017
Kengyel A. (Mentors: Nyitrai, M., Sellers, J.): Investigation of Phosphorylation and Dephosphorylation Processes in the Regulation of Conventional Myosin II and Non-conventional Myosin XVI. PhD thesis., Department of Biophysics, University of Pécs, Medical School, 2017
Holló A. (Mentor: Kengyel, A,): The Effect of Myo16 Ankyrin domain on the actomyosin system. Master's thesis., Department of Biophysics, University of Pécs Medical School, 2017
Henriett Halász, Ali Reza Ghadaksaz, Tamás Madarász, Krisztina Huber, Gábor Harami, Eszter Angéla Tóth, Anikó Osteikoetxea-Molnár, Mihály Kovács, Zsolt Balogi, Miklós Nyitrai, János Matkó and Edina Szabó-Meleg: Live cell superresolution-structured illumination microscopy imaging analysis of the intercellular transport of microvesicles and costimulatory proteins via nanotubes bet, Methods and Applications in Fluorescence, 2018
Dávid Szatmári, Bo Xue, Balakrishnan Kannan, Leslie D. Burtnick, Beáta Bugyi, Miklós Nyitrai, Robert C. Robinson: ATP competes with PIP2 for binding to gelsolin, Plos One, 2018
Nikolett Kis-Bicskei, Bálint Bécsi, Ferenc Erdődi, Robert C. Robinson, Beáta Bugyi, Tamás Huber, Miklós Nyitrai, Gábor Csaba Talián: Tropomyosins Regulate the Severing Activity of Gelsolin in Isoform-Dependent and Independent Manners, Biophysical Journal, 2018
Veronika Takács-Kollár, Miklós Nyitrai, Dénes Lőrinczy, Gábor Hild: Calorimetric characterisation of the toxofilin–G-actin complex, Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 2018
Kengyel A., Telek E., Holló A., Nyitrai, M.: Autoregulatory Functions of Myosin 16 Domains, 47th European Muscle Conference, Budapest, Hungary, Aug 30- Sept 3, 2018
Telek, E., Holló, A., Bécsi, B., Kengyel, A., Erdődi, F., Nyitrai, M.: Binding Properties of the Disordered Myosin 16 Tail Domain, Interdisciplinary Doctoral Conference, Pécs, Hungary, May 17-19, 2018
Holló A., Vékony Zs., Kengyel, A., Nyitrai, M.: The Effect of Myosin 16 Ankyrin domain on the actomyosin system, 48th Membrane-transport Conference, Sümeg, Hungary, May 15-18, 2018
Telek E., Holló A., Bécsi B., Kengyel A., Erdődi F., Nyitrai, M.: Binding properties of the disordered Myo16Tail domain, 62st Annual Meeting of the Biophysical Society, San Francisco, CA, USA, Febr. 17-21, 2018
Kengyel A, Bécsi B, Kónya Z, Sellers JR, Erdődi F, Nyitrai M.: Ankyrin domain of myosin 16 influences motor function and decreases protein phosphatase catalytic activity., Eur Biophys J. 44(4): 207–18, 2015



Back »