photoreceptors, flavoproteins, DNA repair, transcriptional repressor, ultrafast spectroscopy
Discipline
Molecular biology (Council of Medical and Biological Sciences)
40 %
Ortelius classification: Molecular design, de novo design
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)
30 %
Ortelius classification: Enzimology
Biophysics (e.g. transport mechanisms, bioenergetics, fluorescence) (Council of Medical and Biological Sciences)
30 %
Ortelius classification: Molecular biophysics
Panel
Molecular and Structural Biology and Biochemistry
Department or equivalent
Institute of Biophysics (University of Pécs)
Participants
Grama, László Nyitrai, Miklós Orbán, József Raics, Katalin
Starting date
2014-09-01
Closing date
2016-08-31
Funding (in million HUF)
12.252
FTE (full time equivalent)
2.88
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. A természetben számos fehérje - rodopszinok, xantofinok, fototropinok vagy például flavoproteinek - vesz részt a fény érzékelésében, amelyek molekuláris szinten nagyon különböző módon reagálnak a fény abszorpciójára. Jelen pályázat célja a cirkádián ritmusban részt vevő kriptokróm és DNS javító homológjának (fotoliáz) valamint a Rodobacter sphaeroids nevű fotoszintetikus fehérjében található BLUF domén fehérjék fényérzékelésének molekuláris szintű vizsgálata.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. A javasolt projekt keretében arra keressük a választ, hogy hogyan valósul meg a fényérzékelés a DNS javító enzimben, a fotoliázban, valamint a cirkádián ritmust szabályozó kriptokrómokban, vagy egy fotoszintetikus baktérium működését szabályozó AppA-ban. Annak ellenére, hogy a kriptokróm/fotoliáz család és az AppA (és a hozzá hasonló BLUF domén fehérjék) egyaránt a kék fényt érzékelik, molekuláris szinten a mechanizmus nagyon különböző. A kriptokrómokban és fotoliázokban a fényabszorpciót követő elektron transzfer folyamat határozza meg a fehérjék működését, az AppA-ban viszont elsősorban a kék fotonokat abszorbeáló flavin kromofórok körüli hidrogénkötés rendszer átrendeződése kritikus a funkció tekintetében. A kriptokróm/fotoliáz család működésének vizsgálatánál a központi hipotézisünk, hogy a két fehérje - nagy fokú hasonlóságuk ellenére - funkciójában megfigyelhető különbséget a flavin kofaktor redox állapotában megjelenő eltérés okozza. Kísérleteink erre a funkcionális kérdésre adnak választ. A BLUF domén fehérjék, és ezen belül is elsősorban az AppA nevű fehérjével kapcsolatos kísérleteink arra keresnek választ, hogy a flavin fényabszorpcióját követően mi vezet ahhoz a strukturális változáshoz aminek következtében a PpsR nevű transzkripciós faktor disszociálódik az AppA-ról.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! Kutatási eredményeink nem "csupán" a fotoaktív flavoproteinek működésének megértéséhez nyújtanak segítséget, hanem lehetőséget nyitnak bizonyos organizmusok működésének befolyásolására. A közelmúltban elsőként végeztük el az Acinetobacter baumanii nevű baktérium BlsA nevű fehérjének a spektroszkópiai karakterizálását (Brust et al, J. Phys. Chem. Lett, 2014). Az A. baumanii egy olyan kórházakban tenyésző baktérium, amely mára már rezisztenssé vált a legtöbb ismert antibiotikummal szemben. Az A. baumanii-ban található BlsA-ról néhány éve derült ki, hogy az AppA-hoz hasonló BLUF domént tartalmaz, amely felelős a baktérium fényérzékeléséért. Kék fény hatására az A. baumanii motolitása és a biofilm képződés leáll, virulenciája viszont növekszik. Szintén a közelmúltban igazolták azt is, hogy nem csak az A.baumanii hanem a teljes Acinetobacter baktérium család rendelkezik BLUF doménnek, működésüket befolyásolja a kék fény érzékelése. Kutatásaink segítséget nyújthatnak ezeknek a baktériumoknak a működésének a megértéséhez és manipulálásához. Tekintettel a fotoliázok DNS javító funkciójára, valamint a kriptokrómoknak a cirkádián ritmusban betöltött szerepére a kutatás orvosbiológiai hasznossága nyilvánvaló. A kriptokrómokban és fotoliázokban megvalósuló elektron transzfer folyamatok megismerése azonban segítségül lehet még például a hatékonyabb napelemek készítésében is.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. A mindennapi életben körül vagyunk véve olyan organizmusokkal amelyek működésében a kék színű fény érzékelése fontos szerepet játszik. A növények kék színű fény irányába való növekedése, a levelek növekedése, a napraforgók napfény irányába való fordulása, vagy a napi ritmus mind jól ismert folyamatok az ehhez vezető molekuláris események viszont nem vagy kevéssé ismertek. A pályázat keretében egy fotoszintetikus baktériumban található fehérje (AppA) és a fénnyel működő DNS-javító enzim, a fotoliáz működésének molekuláris eseményeit kívánjuk vizsgálni. Tekintettel arra, hogy ezek a molekuláris folyamatok a fényelnyelést követően nagyon rövid idő alatt valósulnak meg, vizsgálatainkhoz olyan ultragyors lézereket használunk majd, amelynek az impulzusa tízezerszer rövidebb mint a másodperc milliárdod része.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. Nature has many elegant ways for light sensing, using photoactive proteins like rodhopsins, xanthophins, photototropins or flavoproteins having very distinct pathways to regulate the photoresponse. The aim of this present project is the investigation of molecular processes of blue light sensing in cryptochromes – blue light sensors involved in regulation of circadian rhythm as well as magnetoreception in brids – and BLUF domain proteins – transcriptional antirepressors in photosynthetic bacteria.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. In the frame of the prsent project we are going to elucidate the molecular mechanism of blue light sensing in the cryptochrome/photolyase and BLUF domain family. Despite the fact that these two big protein families are sensing the light from the same wavelength regime the molecular mechanism is different. In cryptochromes and photolyases a primary electron transfer process takes place, in BLUF domain protein the reorganization of the hydrogen bond network around the flavin chromophore is the crucial mechanism. Our central hypothesis is, that in cryptochromes and photolyases - two homologue protein families - the redox state of the blue light absorbing flavin chromophore will decide whether the protein will repair DNA (photolyase) or will be involved in the regulation of the circadian rhythm (cryptochrome). The proposed experiments of this proposal will shine light on this flavin driven electron transfer process. In the case of BLUF domain protein - and more specially AppA, the best known representative of this family - we will study how the subtle rearrangement of the hydrogen bonding network around the flavin after light absorption leads to the larger conformational changes resulting in the release of the transcriptional factor PpsR.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. The discoveries of the last decade have shown that blue light sensing is ubiquitous in nature and has many relevant implications in many fields of biology and medicine. We recently characterized spectrosocpically - this was the first study ever - BlsA a BLUF domain protein from the bacterium Acinetobacter baumanii (Brust et al., J. Phys. Chem. Lett., 2014). A. baumanii is one of the most well-known multidrug-resistant opportunistic pathogen involved in hospital-acquired infections surviving in unfavorable conditions due to its ability to attach and to form biofilms. Biofilm formation and motility however were found to be linked to light regulation using bLSA. It was only recently found that light regulation is not limited to A. baumanii but for the genus Acinetobacter involving A. nosocomialis and A. pittii found most often in hospitalized patients. As light absorption strongly influences the function of these pathogens, our work to understand the molecular events of light regulation by BLUF domain proteins can help have a deeper insight in the success of survival of these resistant bacteria. The biological and even medical relevance of photolyase research is easy to understand, photolyase being an enzyme which using UV /blue light can repair the UV light induced lesions in DNA – these DNA errors can be the cause of skin cancer. Our research will shine more light on the mechanism on photolyases and cryptochromes, an ubiquitous photoreceptor family which despite their homology have many different functions depending whether they can be found in bacteria, plants, insects or humans. Aside the obvious biomedical implications, our research on long range electron transfer in proteins may help in design of more efficient solar cells.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. In our everyday life we are surrounded by many biological phenomena in which blue light sensing plays an essential role. The directional grow of plants towards the blue light, solar tracking, leaf expansion, stomata opening or cyrcadian rythm are all processes easy to observe but quite difficult to describe on a molecular level. In the frame of present project we propose to elucidate the molecular steps of the photoreception in two proteins, involved in the regulation of cyrcadian rythm (cryptochrome) and light sensing in a photosynthetic bacteria (AppA). Due to the reason that the early molecular events of blue light sensing take place on a very short timescale we will use ultrafast laser spectroscopy to track processes as short as 100 femtoseconds (ten thousand times smaller than a billionth second).
Final report
Results in Hungarian
A projekt során két fotoaktív (Appa, fotoliáz) és egy fluoreszcens (GFP) fehérje funkcionális dinamikáját vizsgáltuk elsősorban ultragyors spektroszkópiai módszerekkel, látható és infravörös tranziens abszorpció segítségével. Az AppA esetében az alapvető kérdésünk az volt, hogy mi okozza a kék fény abszorpcióját követő strukturális változást, amely leállítja a fotoszintetikus gének bioszintézisét. Vizsgálataink azt mutatták, hogy bár más BLUF domén fehérjék esetében elképzelhető, hogy a funkciót egy fotoindukált elektron transzfer okozza, az AppA esetében nem ez a helyzet.
Szemben az AppA-val a fotoliázban az elektron transzfernek van funkcionális szerepe az úgynevezett fotoaktiváció során. A fotoliázon végzett kísérletek esetében arra a kérdésre kerestük a választ, hogy mi okozza a fukcionális különbséget a fotoliázok és a kriptokrómok funkciójában, miközben a két fehérje nagy fokú homológiát mutat. Kísérleteink arra vezettek, hogy elsősorban nem a flavin redoxállapota határozza meg a funkciót, sokkal inkább az izoalloxazin gyűrűhöz közel fekvő aszpartát deprotonációja változtatja meg a fehérjék fotociklusát.
Results in English
In the frame of the project we have studied the functional dynamics of two photoactive (AppA, photolyase) and one fluorescent protein using ultrafast visible and infrared transient absorption spectroscopy.
In the case of AppA – the best characterized BLUF domain protein – our main question was what is the role of the photoinduced electron transfer in the function of the protein. Our studies has shown that despite that electron transfer might have a role in the function of other BLUF domain proteins in the case of AppA ET is not needed.
We also studied electron transfer in photolyase where we know that ET is necessary for the function of the protein. In the case of photolyase our main question was what makes the difference between photolyases and cryptochromes despite the huge similarity in the sequence. Our experiments has shown that the redox state of the flavin does not have decisive influence on the function which is strongly influenced by the deprotonation of the aspartic acid adjacent to the isoalloxazine ring.
Agnieszka Anna Gil, Allison Laura Haigney, Sergey P Laptenok, Richard James Brust, Andras Lukacs, James Iuliano, Jessica Jeng, Eduard Melief, Rui-Kun Zhao, EunBin Yoon, Ian P Clark, Michael Towrie, Gregory M Greetham, Annabelle Ng, James J Truglio, Jarrod B French, Stephen R Meech, Peter J Tonge: Mechanism of the AppABLUF Photocycle Probed by Site-Specific Incorporation of Fluorotyrosine Residues: Effect of the Y21 pKa on the Forward and Reverse Ground-State Reactions, JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY 138:(3) pp. 926-935. (2016), 2016
