A PXE és hasonló meszesedési betegségek kutatási modelljei
Title in English
Model systems in PXE and in related calcification disorders
Keywords in Hungarian
érelmeszesedés, in vivo állatmodellek, fehérje feltekeredés, kémiai chaperonok
Keywords in English
arterial calcification, in vivo animal models, protein folding, chamical chaperons
Discipline
Molecular biology (Council of Medical and Biological Sciences)
75 %
Ortelius classification: Molecular markers and recognition
Cardiovascular system (Council of Medical and Biological Sciences)
25 %
Panel
Physiology, Pathophysiology, Pharmacology and Endocrinology
Department or equivalent
Institute of Molecular Life Sciences (Research Center of Natural Sciences)
Participants
Arányi, Tamás Gulácsiné Bencsura, Petra Huszár, Krisztina Pomozi, Viola Póti, Ádám Szeri, Flóra Tőkési, Natália Vető, Borbála
Starting date
2015-04-01
Closing date
2018-03-31
Funding (in million HUF)
32.692
FTE (full time equivalent)
9.93
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. Az ABCC6 és az ENPP1 génekben bekövetkező mutációk a közepes méretű artériák lamina intima területén, illetve egyéb lágy szövetekben bekövetkező abnormális kalcifikáció kialakulásáért felelősek. A génekhez kötődő betegségek: a pseudoxanthoma elasticum (PXE) és a generalized arterial calcification of infancy (GACI) a kalcifikációs rendellenességek klinikai spektrumának két végletét határozzák meg. A PXE genetikai modellje az általános, öregedéssel összefüggő degeneratív betegségeknek, mint például az időskori makuladegeneráció vagy az érelmeszesedés. Feltételezzük, hogy az ABCC6 és az ENPP1 a lágy szöveti kalcifikáció szabályozásának kulcs fehérjéi, és a májban ugyanannak a hálózatnak tagjaiként működnek. Előzetes eredményeink azt mutatják, hogy az ABCC6 aktivitásának helyreállítása Abcc6-/- egerek májában jelentősen lecsökkenti a kalcifikációt. A PXE-t és GACI-t okozó ABCC6 mutációk nagy része misszensz mutáció, és gyakran a fehérje sejten belüli érésének meghibásodását okozzák. A közelmúltban publikáltuk azt az eredményünket, hogy a sejten belül rekedt, betegséget okozó misszensz ABCC6 mutánsokat kémiai chaperon (4-phenylbutyrate) kezeléssel a plazmamembránba tudtuk irányítani in vivo egér májban. A jelen projekt keretében in vivo és in vitro kísérleti modelleket tervezünk fejleszteni, amelyek alkalmasak a sejten belüli lokalizáció vizsgálatára, valamint – ami még fontosabb – a betegséget okozó ABCC6 mutánsok funkciójának helyreállítására kémiai chaperon gyógyszermolekulákkal. Vizsgálni szeretnénk továbbá, hogy a CDCA (chenodeoxycholic acid) milyen hatással van az ABCC6- illetve ENPP1-mediált lágy szöveti kalcifikációra.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. Hipotézist állítottunk fel azokra a tényekre támaszkodva, hogy mindkét kalcifikációs rendellenesség nagyon hasonló tüneteket mutat (noha megjelenésükben néha különbözőek, valamint hogy mind az ENPP1 mind az ABCC6 fehérje a májban expresszálódik. Feltételezzük, hogy az ABCC6 és az ENPP1 a lágy szöveti kalcifikáció szabályozásának kulcs fehérjéi, és a májban ugyanannak a hálózatnak a tagjaiként működnek. (Ez egyben azt is jelenti, hogy mind a PXE, mind a GACI metabolikus betegség.) A jelen pályázatban az ABCC6 fehérjére összpontosítunk, elsősorban a fehérje aktivitásának helyreállítására a májban. A projekt nemzetközi együttműködés keretében erősen kapcsolódik a Th. Jefferson University, Philadelphia, PA, USA. egyetemen futó kutatási programhoz. A betegséget okozó ABCC6 mutánsok aktivitásának helyreállításához kémiai chaperonokat tervezünk használni. Ennek a célnak az elérése érdekében in vitro (sejtes) és in vivo (egér) kísérleteket és preklinikai modelleleket fejlesztünk. Tervezzük vizsgálni továbbá, hogy az FXR agonista CDCA (chenodeoxycholic acid) milyen hatással van az ABCC6- illetve ENPP1-mediált lágy szöveti kalcifikációra.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! Az in vitro és in vivo kísérleti modellek lehetőséget biztosítanak olyan preklinikai kutatásokhoz, amelyek kalcifikációs rendellenességek farmakológiai kezelését célozzák meg. Eredményeink a következő alapvető tudományos kérdéseket fogják megválaszolni: i/ mely genomban kódolt chaperon fehérjék érzékenyek a kémiai chaperon kezelésekre, azaz potenciális gyógyszer-célpontokat határozhatunk meg ii/van-e kapcsolat a „CDCA szabályozási útvonal” és az ABCC6-mediált anti-kalcifikációs szabályozási útvonal között? Kísérleti célkitűzéseink elérése azt bizonyítja majd, hogy az ABCC6 mutánsok kijuttatása a májsejtek plazmamembránjába in vivo a (már klinikumban használt) 4-PBA vagy más, a jelen projekt során azonosított kémiai chaperon kezelés hatására allél-specifikus terápiás megoldás lehet a két – jelenleg nem gyógyítható – genetikai betegség, PXE és GACI esetében. Továbbá a CDCA szabályozási útvonalhoz kapcsolódó metabolitok újfajta farmakológiai terápiát tehetnek lehetővé a lágy szöveti/érfali meszesedéssel járó klinikai tünetek esetében.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. Számos betegség, klinikai kórkép oka egy adott, kulcsfontosságú fehérje génjében bekövetkezett mutáció, amely a fehérje alakját (“konformációját”) megváltoztatja. A mutáns fehérje – habár sok esetben működőképes – nem képes a konfromációjában beállt változás miatt eljutni a sejten belül arra helyre (esetleg a sejtből kijutni), ahol funkcióját el kell látnia. Kutatásainkban az artériák meszesedésében fontos szerepet játszó membránfehérje betegséget okozó formáival foglalkozunk. Ezeknek a betegségeknek a kezelése nem megoldott. Kutatásainkban olyan gyógyszermolekulákat keresünk, amelyek – közvetett módon – segítik a mutáns fehérje konformációjának “kijavítását”, és ezáltal az eredeti funkció helyreállítását. Olyan állatmodellt hoztunk létre, amely az emberi fehérje mutáns formáit hordozza. Az előzetes, ezeken az állatmodelleken végzett kísérleteink azt bizonyítják, hogy az ilyen törekvések sikeresek lehetnek. Az általunk vizsgált ritka öröklődő meszesedési betegségekben a páciensek mintegy 70%-a számára ez a gyógyszeres megközelítés új elveken alapuló lehetőségeket biztosít a gyógyító beavatkozásra.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. Abnormal mineralization in the lamina intima of middle sized arteries and in other soft tissues can be due to mutations in two genes: either in ABCC6 or in ENPP1 gene. The associated disorders, pseudoxanthoma elasticum (PXE) and generalized arterial calcification of infancy (GACI) represent the two extreme ends of a clinical spectrum of calcification disorders. PXE serves as a genetic model of common, “acquired” age-associated degenerative diseases, like macular degeneration and vascular calcification. We suggest that ABCC6 and ENPP1 are key protein components of regulation of soft tissue calcification acting as members of the same network in the liver. Our preliminary results suggest that restoring ABCC6 activity specifically in the liver of Abcc6-/- mice attenuates calcification significantly. Mutations causing PXE and GACI are mostly missense, frequently resulting in incorrect cellular localization into the plasma membrane. We have published very recently that disease-causing missense ABCC6 mutants accumulating intracellularly can be redirected into the plasma membrane in vivo in mouse liver using the chemical chaperon, 4-phenylbutyrate (4-PBA). In the proposed project we plan to establish a in vivo and in vitro experimental models to investigate the cellular localization and - more importantly – the functional rescue of disease-causing ABCC6 mutants using various chemical chaperons. We also plan to elucidate the role of the “chenodeoxy cholic acid pathway” in ABCC6- and in ENPP1-mediated calcification.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. We have developed the hypothesis considering the facts that the two calcification disorders are very similar in symptoms (though maybe different in their manifestation) and both ENPP1 and ABCC6 are expressed in the liver. We suggest that ABCC6 and ENPP1 are key protein components of regulation of soft tissue calcification acting as members of the same network in the liver. (This implies that both PXE and GACI are metabolic disorders.) In the present proposal we focus on ABCC6 and the restoration of its activity in the liver. The project has a strong international collaborative connection to the program running at the Th. Jefferson University, Philadelphia, PA, USA. Here we propose to utilize chemical chaperons to restore the activity of disease-causing missense mutants of ABCC6. In order to achieve this goal we develop in vitro (cellular) and in vivo (mouse) experimental/preclinical models. We also propose to investigate the effect of FXR-agonist chenodesoxy cholic acid on the ABCC6- and ENPP1-mediated soft tissue calcification.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. The in vitro and in vivo experimental models will open reasearch for preclinical invetsigations of various pharmacological interventions in calcification disorders. Our results will answer the following basic science questions: i/ which genome-encoded chaperon proteins are sensitive to the various chemical chaperon treatments, thus identifying them as drug targets, ii/ is there any relationship between the “chenodeoxy cholic acid pathway” and the anti-calcification pathway ABCC6 is involed in? Achieving our aim will demonstrate that the pharmacologically assisted “guiding” of ABCC6 mutant proteins into the plasma membrane of hepatocytes in vivo with the “repurposing” use of 4-PBA or other chemical chaperons identified during the project might be a feasible allele-specific therapeutic solution in the two – currently incurable – genetic disorders, pseudoxanthoma elasticum and generalized arterial calcification of infancy. In addition, metabolites of the “chenodeoxy cholic acid pathway” may provide novel pharmacological solutions in treating soft tissue/arterial calcification clinical conditions.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. The cause of several disease / clinical symptom are mutations occuring in the gene of a key protein, leading to conformational changes in the protein stucture. Mutant proteins – even though usually they are functionally active – cannot reach their place within (or outside) the cell, where they supposed to act, due to the conformational change caused by the mutation. In our research we investigate disease-causing forms of a mebrane protein, playing important role in the calcification of arteries. Currently these diseases are uncurable. In this research project we plan to identify such drug molecules, which are able – in an indirect way – to “correct” the conformation of the mutant protein, thus restoring its function. We have generated an animal model, which expresses the mutant variants of the human protein. Our preliminary results obtained using this animal model shows that our hypothesis is feasible. This pharmacological approach opens a new possibility toward the treatment of approximately 70% of patients suffering from the rare, heritable calcification disorders investigated in our laboratory.
Final report
Results in Hungarian
A PXE vizsgálatára, azaz a kalcifikáció mértékének csökkentése érdekében kétféle preklinikai modellt állítottunk be és jutottunk eredményre:
I. Kimutattuk, hogy a 4-PBA kémiai chaperon molekula segíti a mutáns ABCC6 fehérjék érését és plazmamembránba való kijutását. A PXE humanizált egér modelljében azt vizsgáltuk, hogy a 4-PBA kezelés képes-e helyreállítani bizonyos betegséget okozó ABCC6 mutánsok kalcifikációt gátló hatását. A 4-PBA kezelés helyreállította a mutáns ABCC6 fehérjék fiziológiás funkcióját, amely a kalcifikáció gátlásában nyilvánult meg. Eredményeink alapján a 4-PBA ígéretes allél-specifikus terápiás lehetőség az ABCC6-hoz kötődő kalcifikációs rendellenességek kezelésére.
II. Általánosan elfogadott tény volt, hogy a szájon át adott PPi felszívódása nulla. Ezzel a feltételezéssel ellentétben mi emelkedett PPi szintet mértünk azoknak az egyedeknek a keringésében, akik előzőleg pirofoszfátot fogyasztottak. A PXE és a GACI egér modelljében a bőrt, veséket és artériákat érintő ektópiás kalcifikációt az ivóvízhez adott PPi lecsökkentette.
Eredményeink azt mutatják, hogy a szájon át adott PPi felszívódik emberekben, és képes a PXE és GACI egér modelljeiben megakadályozni a lágy szöveti kalcifikációt. Mivel a PPi az FDA által már jóváhagyott és biztonságosnak ítélt szer, ez egy nagyon ígéretes, hatékony és olcsó kezelési lehetőség a jelenleg gyógyíthatatlan PXE és GACI genetikai betegségekre, valamint egyéb, lágy szöveti kalcifikációval járó rendellenességekre.
Results in English
We have established two preclinical models for intervening of PXE, i.e. progression of calcification.
I. We have shown that the chemical chaperone 4-phenylbutyrate (4-PBA) promotes the maturation of ABCC6 mutants to the plasma membrane. In a humanized mouse model of PXE, we investigated whether 4-PBA treatments could rescue the calcification inhibition potential of selected disease-causing ABCC6 mutants. 4-PBA administrations restored the physiological function of ABCC6 mutants resulting in calcification inhibition. This study identifies 4-PBA treatments as a promising strategy for allele-specific therapy of ABCC6-associated calcification disorders.
II. It was always assumed that the bioavailability of orally administered PPi is zero. In contrast to this assumption we detected increased PPi concentrations in the circulation of humans that ingesting pyrophosphate. In mouse models of PXE and GACI, PPi provided via the drinking water attenuated the ectopic calcification phenotype (skin, kidney and arteries).
Our work shows that orally administered PPi is readily absorbed in human and inhibits connective tissue calcification in mouse models of PXE and GACI. PPi, which is recognized as safe by FDA, therefore not only has great potential as an effective and low cost treatment for these currently intractable genetic disorders, but also in other conditions involving connective tissue calcification.
Karasik A, Ledwitch KV, Arányi T, Váradi A, Roberts A, Szeri F.: Boosted coupling of ATP hydrolysis to substrate transport upon cooperative estradiol-17-β-D-glucuronide binding in a Drosophila ATP binding cassette type-C transporter., FASEB J. 32(2):669-680, 2018
Rashdan NA, Rutsch F, Kempf H, Váradi A, Lefthériotis G, MacRae VE.: New perspectives on rare connective tissue calcifying diseases., Curr Opin Pharmacol. 28:14-23. doi: 10.1016, 2016
Li Q, Arányi T, Váradi A, Terry SF, Uitto J.: Research Progress in Pseudoxanthoma Elasticum and Related Ectopic Mineralization Disorders., J Invest Dermatol;136(3):550-6. doi: 10.1016/j, 2016
Pomozi V, Brampton C, Szeri F, Dedinszki D, Kozák E, van de Wetering K, Hopkins H, Martin L, Váradi A, Le Saux O.: Functional Rescue of ABCC6 Deficiency by 4-Phenylbutyrate Therapy Reduces Dystrophic Calcification in Abcc6-/- Mice., J Invest Dermatol.137(3):595-602, 2017
Dedinszki D, Szeri F, Kozák E, Pomozi V, Tőkési N, Mezei TR, Merczel K, Letavernier E, Tang E, Le Saux O, Arányi T, van de Wetering K, Váradi A.: Oral administration of pyrophosphate inhibits connective tissue calcification., EMBO Mol Med. 9(11):1463-1470., 2017
Váradi A, Fülöp K, Arányi T, Szeri F: Tissue-nonspecific alkaline phosphatase: a promising target for pseudoxanthoma elasticum therapy, Ann Transl Med. 5(24):489., 2017
Uitto J, Li Q, van de Wetering K, Váradi A, Terry SF.: Insights into Pathomechanisms and Treatment Development in Heritable Ectopic Mineralization Disorders, J Invest Dermatol, 2016
Váradi A.: It is all about calcification, Cell Cycle. 13(24):3793., 2016
