|
 |
Details of project |
|
|
| Identifier |
115568 |
| Type |
PD |
| Principal investigator |
Nagy, Péter |
| Title in Hungarian |
Gyulladásos bélbetegség modellezése Drosophila-ban |
| Title in English |
A Drosophila model of inflammatory bowel disease |
| Keywords in Hungarian |
autofágia differenciálódás Drosophila gyulladás őssejt |
| Keywords in English |
autophagy differentiation Drosophila inflammation stemcell |
| Discipline |
| Development, developmental genetics, pattern formation and embryology (Council of Medical and Biological Sciences) | 40 % | | Signal transduction (Council of Medical and Biological Sciences) | 30 % | | Cell biology and molecular transport mechanisms (Council of Medical and Biological Sciences) | 30 % |
|
| Panel |
Cellular and Developmental Biology |
| Department or equivalent |
Department of Anatomy, Cell and Developmental Biology (Eötvös Loránd University) |
| Starting date |
2015-11-01 |
| Closing date |
2017-10-31 |
| Funding (in million HUF) |
16.140 |
| FTE (full time equivalent) |
1.80 |
| state |
closed project |
Summary in Hungarian A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
A Crohn betegség (CD) egy kóros, bélrendszert érintő gyulladásos állapot, ami genetikai, környezeti és bakteriális tényezők összjátéka miatt alakul ki. A betegség létrejöttében és lefolyásában szerepet játszó kóros mechanizmusok kevéssé ismertek. Genomszintű szekvenálási kísérletek során 90 olyan génmutációt azonosítottak, melyek a betegség előfordulásának kockázatát emelik. Az Atg16 gén egyik mutáns allélje is hajlamosít a CD kialakulására. Ez egy központi autofág gén, tehát ennek az evolúciósan konzervált lizoszómális önlebontó útvonalnak a szabályozásában játszik szerepet. A Drosophila melanogaster már jól bevált alanya alapvető sejtbiológiai és genetikai vizsgálatoknak, így a meglevő különféle Atg16 funkcióvesztéses állatainkat szeretném elemezni kísérleteim során. Egészséges és fertőzött vad típusú és Atg16 mutáns legyek belében meg fogom határozni az autofágia szintjét, a bélszövet regenerációs kapacitását, gyulladásos jelátviteli folyamatok aktivitását, az anti-mikrobiális fehérjék termelődését és szekrécióját, az őssejt osztódást és az őssejt niche-ben bekövetkező változásokat, és az állatok élethosszát. Az Atg16 bél őssejt osztódásban és differenciálódásban betöltött szerepét is tervezem megvizsgálni mutáns állatok belében, valamint RNS interferencia által csak bizonyos bélsejt-típusokban csendesített Atg16 esetén. Az endogén promóter által irányítottan kifejeződő Atg16 jelölésével meg fogom vizsgálni a fehérje kifejeződési mintázatát. Eredményeim remélhetőleg feltárják majd az Atg16 eddig nem ismert funkcióit a bél homeosztázis fenntartásában, mely hozzájárulhat jövőbeni terápiák és biomarkerek kifejlesztéséhez a Crohn betegek szűrése és gyógyítása során.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
Kutatásunk legfőbb kérdése az Atg16 szerepének felderítése a bélhomeosztázis fenntartásában. Első célunk az autofágia szintjének tanulmányozása egészséges és fertőzött vad típusú és Atg16 mutáns legyek belében az általunk fejlesztett riporterek felhasználásával. Az Atg16 kifejeződési mintázatát az endogén promóter által szabályozott HA jelölt fehérje immunjelölésével tervezem megvizsgálni. Következő célunk az Atg16 őssejt differenciálódásban betöltött szerepének vizsgálata a belet alkotó sejteket specifikusan jelölő ellenanyagok felhasználásával. A normális őssejt niche fenntartásában szerepet játszó jelátviteli útvonalak aktivitását is meg fogom vizsgálni vad típusú és Atg16 mutánsokban. Az Atg16 RNS interferencia általi sejtspecifikus csendesítése során kideríthetjük, hogy az Atg16-nak milyen szerepe van a belet felépítő különböző sejtekben, vagyis az őssejtekben, enteroblasztokban, enteroendokrin sejtekben és az enterocitákban. A megváltozott jelátviteli útvonalak különböző sejttípusokban történő genetikai módosításával feltárhatóak lesznek az Atg16 hiányában kialakuló különböző molekuláris mechanizmusok. Az Atg16 mutánsok belében található enteroendokrin sejtekben meg fogom vizsgálni az endoplazmatikus stressz szintjét, ami a CD esetén a Paneth sejtekre jellemző. Harmadik fő célunk bakteriális fertőzés során (Pseudomonas aeruginosa és Enterococcus faecalis) a túlélés, a bélszövet regeneráció, egy gyulladási útvonal aktivitás, őssejt osztódás és antimikrobiális peptid szekréció vizsgálata vad típusú és Atg16 mutáns legyek felhasználásával.
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
Modern nyugati társadalmunk számos súlyos betegség által érintett, ilyen például a gyulladásos bélbetegségek egyik komoly formája a Crohn betegség (CD). Annak ellenére, hogy életmódunk és környezetünk alapvetően befolyásolják betegségek kialakulását, a genetikai rizikó tényezők központi szerepe megkérdőjelezhetetlen ezekben a folyamatokban. A Crohn betegség kialakulásában szerepet játszó hajlamosító genetikai tényezők és hatásaik kevéssé ismertek annak ellenére, hogy több millió embert érintő komoly bélgyulladásos betegségről van szó. Mivel a betegség kialakulásában és lefolyásában szerepet játszó bonyolult patomechanizmusok alig ismertek és sejtkultúrában lehetetlen vizsgálni ezeket, ezért hasznos lenne egy egyszerű modellállatban a különböző mechanizmusok modellezése. Az ösztöndíjas időszak alatt tervezem a CD Drosophila modelljének kidolgozását és vizsgálatát. Az autofágiát szabályozó Atg16L1 mutációi a legfőbb genetikai hajlamosító tényezők közé sorolhatók a Crohn betegség kialakulása során. Az autofágia egy olyan lizoszómális lebontó útvonal, ami központi fontosságú sejtvédelmi funkciót lát el. Meghibásodása számos emberi betegséggel kapcsolatba hozható úgy, mint a neurodegeneráció és a rák. Előzetes kutatási eredményeink alapján három különböző Atg16 mutáns légy belében súlyos differenciálódási hibát azonosítottunk. A bélben megfigyelhető őssejtleszármazás és differenciálódás vizsgálatával remélhetőleg új, eddig nem azonosított bél homeosztázisban betöltött funkcióit azonosíthajtuk majd az Atg16-nak. Remélhetőleg az Atg16-hoz kapcsolódó újabb, krónikus gyulladásban szerepet játszó tényezőket is sikerül majd azonosítani. Az antibakteriális autofágia vizsgálata a különböző Atg16 mutánsokban segíthet megérteni az emberi CD-re hajlamosító Atg16 allélekben azonosított mutációk természetét. Kutatásaink segítik majd az Atg16 szerepének részletesebb megismerését a CD során. Úgy tűnik ugyanis, hogy ennek a gyulladási bélbetegségnek a kialakulásához részben hozzájárulnak az enteroendokrin sejtek/Paneth sejtek differenciálódásában és az őssejt niche-ben bekövetkező változások.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
A Crohn betegség egy súlyos bélgyulladással járó kór és több millió embert érint világszerte. A betegek több, mint fele műtéti beavatkozásra szorul, de lényeges kiemelni, hogy a beavatkozás nem gyógyítja a betegséget, csupán a súlyos gyulladással érintett bélszakaszok eltávolításáról van szó. A betegség kialakulásában genetikai, környezeti és bakteriális tényezők is szerepet játszanak, de a kórkép kialakulásához hozzájáruló sejtbiológiai folyamatok kevéssé ismertek. Az Atg16 gén mutációját azonosították többek között Crohn betegekben, mint lényeges hajlamosító tényezőt a betegség kialakulására. Az Atg16 az autofágia szabályozásában központi szerepet játszik, így biztosítva a sejtek megfelelő védekezését stresszel és fertőző bektériumokkal szemben. Az ecetmuslica (Drosophila melanogaster) kíváló alanya sejtbiológiai és genetikai vizsgálatok kivitelezésére, melyek közelebb vihetnek akár olyan komplex megbetegedések megértéséhez, mint a Crohn betegség. Az ösztöndíj során meg fogom vizsgálni az autofágia szintjét, egy gyulladási útvonal aktivitását valamint a sejtleszármazás és differenciálódás végbemenetelét egészséges és fertőzött vad típusú és Atg16 mutáns legyekben. Úgy gondoljuk, hogy kutatásaink feltárják majd az Atg16 bélhomeosztázis fenntartásában betöltött eddig még nem ismert szerepét, ami közelebb vihet a Crohn betegség kialakulása során bekövetkező sejtbiológiai folyamatok megértéséhez. Reményeink szerint eredményeink hozzájárulhatnak továbbá olyan jövőbeni terápiák kidolgozásához és biomarkerek fejlesztéséhez, melyek lehetővé teszik a betegség kezelését, a betegek hatékony szűrését, ami az elkerülhetetlen műtéti beavatkozások számát is nagymértékben csökkentené.
| Summary Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
Crohn’s disease (CD) is a chronic, severe disorder resulting from genetic, environmental and microbial factors. The complex etiology of this inflammatory bowel disease is an enigma, as the underlying molecular mechanisms still remain elusive. Genome-wide association studies identified genetic susceptibility loci linked to an increased risk for developing CD. A polymorphism of Atg16 is a major risk factor associated with this disease. Atg16 is a core autophagy-related gene involved in the lysosomal self-degradation pathway called autophagy. I propose to study Atg16 function in midgut homeostasis by using the versatile and genetically tractable model organism Drosophila. I will monitor the level of autophagy in control and Atg16 mutant guts in normal condition and during bacterial infections. In addition, the survival rate, gut regeneration, inflammatory pathway activity, antimicrobial peptide expression and secretion, intestinal stem cell proliferation and differentiation, and changes in the stem cell niche will be analyzed during normal and infected conditions. The cell lineages will be traced in three different Atg16 mutant guts and in animals with RNAi mediated, cell type-specific loss of Atg16. Alterations will be further analyzed by modulating the relevant signaling pathways in Atg16 mutant guts to validate the molecular mechanisms responsible for the observed phenotypes. Preliminary data suggest that my research will reveal novel fundamental functions of Atg16 in gut homeostasis, such as impaired differentiation of Paneth-like enteroendocrine cells and altered stem cell niche. I hope that the results will pave the way for novel therapies of CD.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
The main purpose of my proposal is to determine the contribution of Atg16 to gut function in Drosophila. To achieve this, the first specific aim is to establish the level of autophagy in normal and infected guts of control and Atg16 mutant flies, using our existing reporters and tools. Atg16 localization will be also assessed by indirect immunolabeling of a HA tagged version of Atg16, whose expression is regulated by its endogenous reporter. The second specific aim is to trace cell lineages in the guts of three different Atg16 mutants by using specific markers for different cell types of the adult Drosophila gut. Signaling pathways involved in the proper differentiation of cells and maintenance of the stem cell niche will be analyzed in control and Atg16 mutant guts as well. Cell type-specific RNAi knockdown of Atg16 will be monitored to determine stem cell, enteroblast, enteroendocrine cell or enterocyte specific effects. Altered signaling pathways will be manipulated in different cell types of Atg16 mutants to validate the molecular mechanisms behind Atg16 mutant gut phenotypes. Endoplasmic reticulum stress will also be studied in enteroendocrine cells (these cells fulfill roles similar to mammalian Paneth cells whose function is altered in CD) of Atg16 mutant flies, as this was suggested to contribute to CD. The third specific aim is to study survival rate, gut regeneration, inflammatory pathway activity, stem cell proliferation and antimicrobial peptide secretion in normal and infected guts of control and Atg16 loss-of-function flies. The opportunistic human pathogens Pseudomonas aeruginosa and Enterococcus faecalis can be used for infecting flies.
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
Our modern society is increasingly affected by severe disorders including inflammatory bowel disease. Although our lifestyle and environment has an influence on disease progression, there is no doubt that genetic factors are associated with the pathological alterations leading to such disorders including Crohn's disease (CD). Factors causing CD are poorly characterized, so the relevant pathomechanisms are incompletely understood despite the fact that millions of patients are affected around the world. Due to the complex nature of this human disorder that is impossible to model in cultured cells, it may be easier to identify the most important defects in a simple animal model. I will establish and characterize a Drosophila model of CD. Mutations of the autophagy gene Atg16L1 are major risk factors for CD based on genome-wide association studies. Autophagy is an ancient lysosomal self-degradation pathway and its dysfunction is associated for instance with aging, neurodegeneration, cancer initiation and progression. Our preliminary experiments in Drosophila revealed a serious defect in intestinal stem cell differentiation of Atg16 mutant flies. I will identify novel pathways and factors leading to chronic inflammation and impaired gut function by utilizing this genetically tractable model organism. By monitoring cell lineages and the differentiation status of cells originating from stem cells, hopefully I will identify novel key players required for sustained gut homeostasis that are altered by loss of Atg16. Studying the activity of inflammatory responses upon bacterial infection in wild type and mutant animals will be important to understand the role of Atg16 in chronic inflammation. I will monitor changes in antibacterial autophagy in our different Atg16 mutants compared to control animals, to model the impact of the point mutant risk alleles in the human disease. This project will likely provide critical new insights into the relevance of Atg16 mutations in CD. Specifically, the development of this inflammatory bowel disease may turn out to be at least in part caused by a failure of proper enteroendocrine/Paneth cell differentiation and an altered stem cell niche.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
Crohn's disease (CD) is a severe inflammatory bowel disease affecting millions of patients around the world. Up to one-half of these individuals require surgery to ensure survival, however it does not cure CD. Genetic, microbial and environmental factors all contribute to disease progression, but the underlying alterations on the cellular and tissue level are incompletely understood. Mutations in a gene called Atg16L1 are one of the major risk factor for developing CD. This gene is involved in autophagy, a process that ensures the breaking down of old and unnecessary components within cells as well as invading pathogens such as bacteria. The fruit fly Drosophila is a popular and proven animal model for studying the molecular, cell and developmental aspects of various human disorders and autophagy gene mutations, so I plan to use the gut of adult flies for understanding certain aspects of CD. During this project I will monitor autophagy, inflammation, cell-to-cell communication pathways and alterations in the continuous generation of different cell types (which is necessary for the maintenance of gut function), using not only properly cultured wild type and Atg16 mutant flies but also during bacterial infections. I hope to discover currently unknown roles of Atg16 and autophagy in inflammation and gut homeostasis. These results may aid the development of future therapies for CD, and perhaps reduce the number of inevitable surgical interventions.
|
|
|
|
|
