A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. Az élő szervezetek genomi DNS-ét folyamatos károsodás éri. A legveszélyesebb DNS-hiba a kettőstörés (double-strand break, DSB), ami genetikai instabilitáshoz és rákhoz vezethet. A DSB-k hibamentes javítása leghatékonyabban homológ rekombináció (HR) segítségével érhető el. A HR a DSB-javításon túlmenően – a meiózis során – a genetikai sokféleség létrehozásához és a kromoszóma-szegregáció megfelelő lezajlásához is elengedhetetlen. A RecQ-családba tartozó helikázok a HR központi motorjai és szabályozói. Ezek az enzimek széttekerik a DNS-szálakat, és átalakítják a DNS-molekulák szerkezetét. Funkciókiesésük túlzott rekombinációt, magas rákhajlamot és felgyorsult öregedést okoz. A közelmúltban a humán Bloom-szindróma helikáz (BLM, RecQ-családtag) HR-köztitermék DNS-struktúrákat sokoldalúan feldolgozó komplex aktivitásait fedeztük fel. E felfedezéseinknek és újonnan kiépített képalkotó berendezéseinknek köszönhetően előnyös helyzetben vagyunk az új, összetett HR tevékenységek felderítéséhez. A javasolt projektben egyrészt felderítjük a DNS csomópont-migráció eddig ismeretlen mechanizmusát teljes belső visszaverődés fluoreszcencia mikroszkópiás (TIRFM) egyedimolekula-eljárással (1. cél), másrészt azt is meghatározzuk, hogy a csomópont-migráció és DNS-szerkezetátalakítás hogyan járul hozzá a DNS-javításhoz és a kromoszómák megfelelő szegregációjához élő állatban (C. elegans modellrendszer és kétfoton-mikroszkópia segítségével; 2. cél).
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. Az 1. célhoz tartozó kísérleteinkben meghatározzuk a HR egyik kritikus végső lépésének, a kettős Holliday-csomópont (DHJ)-felbontásnak a molekuláris mechanizmusát, amelyet a BLM helikáz és partnerfehérjéi (BTR komplex) végeznek. A következő kérdésekre keresünk választ: Hogyan történik a HJ-migráció katalízise? Mi a szerepe a BTR komplex egyes alegységeinek? Mennyire processzív a DNS-felbontó komplex? Milyen mértékben pótolhatják más RecQ-családbeli helikázok a BLM funkcióját? A 2. célhoz tartozó kísérleteinkben a C. elegans fonalféreg BLM ortológjának (HIM-6/BLM) az élő állatban betöltött genomkarbantartó funkcióját fogjuk meghatározni. A következő kérdésekre keresünk választ: Hogyan járulnak hozzá a HIM-6/BLM aktivitásai a HR korai (DNS-reszekció) és/vagy késői eseményeihez (HJ-migráció) a meiózis során? Hogyan segíti elő a HIM-6/BLM a pontos kromoszóma-szegregációt? Melyek a HIM-6/BLM fehérjepartnerei? Mely fehérjék befolyásolják a HIM-6/BLM kifejeződését a meiotikus fázisok során? Hogyan vesz részt a HIM-6/BLM a szomatikus DNS-hibajavításban?
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! (1) A HR elengedhetetlenül szükséges a sejtek rákos átalakulásának elkerüléséhez. Élvonalbeli egyedimolekula-kísérleteinkben meghatározzuk, hogy a humán Bloom-szindróma helikáz hogyan katalizálja a DNS-csomópontok migrációját, így mitotikus sejtekben elkerülve a genetikai átkereszteződést, a genetikai instabilitást és a rák kialakulását. (2) A molekuláris mechanizmusvizsgálatok ritkán kapcsolódnak közvetlenül a biológiai kimenet meghatározásához. Élvonalbeli egyedimolekula-biokémiai/biofizikai kísérleteinket a projektben összekapcsoljuk a biokémiai folyamatok az élő szervezetben kifejtett hatásának vizsgálatával. Ezáltal képesek leszünk meghatározni a molekuláris összetevők mechanisztikus szerepét az életfolyamatok különböző komplexitási szintjein – mind a mitotikus, mind a meiotikus rekombináció kontextusában. (3) Kutatásaink hozzájárulnak annak felderítéséhez, hogy a HR-alapú genomkarbantartás hogyan járul hozzá a sejthalál és a rák megelőzéséhez, hogyan alakul ki malignus átalakulás hibás vagy ellenőrizetlen HR következtében, illetve hogy a megfelelően szabályozott HR a meiózis során hogyan járul hozzá a genetikai sokszínűség létrehozásához – a genomstabilitást érintő negatív következmények minimalizálása mellett.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. Az élő szervezetek genetikai anyagát folyamatos károsodás éri. A DNS-kettősspirál mindkét szálának együttes törése káros következményekhez: a genetikai anyag instabilitásához és rák kialakulásához vezethet. A homológ rekombináció (HR) olyan biológiai folyamat, amely képes a törött DNS hibamentes javítására egy épen maradt DNS-kópia információjának felhasználásával. A HR a DNS-javítás mellett – az ivaros szaporodás során – a genetikai sokféleség létrehozásához is elengedhetetlen. Kutatásunk középpontjában a Bloom-szindróma helikáz (BLM) áll. E fehérje a DNS-molekulák szerkezetének átalakítását végzi. A BLM hiánya magas rákhajlamot okoz, ami a fehérjének a HR szabályozásában betöltött központi szerepét jelzi. A közelmúltban a BLM sokoldalú DNS-szerkezetátalakító aktivitásait fedeztük fel. E felfedezéseinknek és újonnan kiépített képalkotó berendezéseinknek köszönhetően előnyös helyzetben vagyunk az új, összetett HR-folyamatok felderítéséhez. A javasolt projektben egyrészt – élvonalbeli egyedimolekula-manipulációs kísérletekkel – meghatározzuk a DNS-feldolgozás ismeretlen biokémiai mechanizmusait, másrészt – C. elegans fonalféreg állatmodell alkalmazásával – azt is felderítjük, hogy e mechanizmusok hogyan járulnak hozzá a sérült DNS javításához az élő szervezetben.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. The genomic DNA of all living organisms is constantly exposed to damage. The most dangerous DNA lesions are double-strand breaks (DSBs), which can result in genomic instability and cancer. Error-free repair of DSBs can be achieved via homologous recombination (HR). Besides DSB repair, HR is also used to generate genetic diversity and ensure proper chromosome segregation during meiosis. RecQ-family helicases are central engines and/or regulators of HR. These enzymes can unwind and restructure DNA molecules. Their deficiencies cause excessive recombination, high cancer predisposition and accelerated ageing. Recently we found that human Bloom’s syndrome helicase (BLM, a RecQ family member) performs versatile complex activities to process HR-intermediate DNA structures. Based on our recent discoveries and our recently built equipment capacities, we are in a unique position to explore novel complex HR activities. In the proposed project, we will determine the unknown mechanism of migration of DNA junctions (a key complex DNA-restructuring activity of BLM) at the single-molecule level using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) (Aim 1), and explore how junction migration and resolution complexes enable DNA repair and proper chromosome segregation in live animals using 2-photon microscopy (2PM) in C. elegans animal model system (Aim 2).
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. In Aim 1 we will determine the molecular mechanism of the critical final steps of an important HR pathway in which a HR-intermediate complex DNA structure, the double Holliday-junction (DHJ), is dissolved by BLM helicase and its partner proteins (BTR complex). We will address the following questions: How is HJ migration catalyzed? What are the roles of the subunits of the BTR complex? How processive is the dissolvasome? How specific is the DHJ migration to the BTR complex compared to other human RecQ-family helicases? In Aim 2 we will explore the genome-maintaining functions of the C. elegans BLM ortholog (HIM-6/BLM) in live animals. We will address the following questions: How is HIM-6/BLM involved in early (DNA resection) and/or late phases (HJ branch migration and DHJ dissolution/resolution) of meiotic recombination? How does HIM-6/BLM support faithful chromosome segregation? What are the protein partners of HIM-6/BLM? Which protein factors affect HIM-6/BLM expression during meiotic phases? How is HIM-6/BLM involved in somatic DNA repair?
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. (1) HR is essential for avoiding cancerous transformation of cells. In our cutting-edge single-molecule experiments we will determine how human Bloom’s syndrome helicase catalyzes migration of DNA junctions, a process that helps to avoid mitotic crossing-over and consequent genomic instability and cancer. (2) Molecular mechanistic studies are rarely linked directly to biological outcome. We will combine the cutting-edge single-molecule biochemical/biophysical experiments with advanced microscopic investigation of the effect of the studied biochemical processes in a living organism. This way we will be able to determine the mechanistic roles of molecular components across different levels of complexity, in the contexts of both mitotic and meiotic recombination. (3) Exploration of the above processes will advance our perspective on how cell death and cancer are prevented via HR-based genome maintenance, how malignant transformation develops as a result of inefficient or uncontrolled HR, and how HR is controlled during meiosis to generate genetic diversity with minimal negative consequences on genome stability.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. The genomic DNA of all living organisms is constantly exposed to damage. Breakage of both strands of the DNA double helix can lead to harmful consequences including instability of the genetic material and cancer formation. Homologous recombination (HR) is a biological mechanism that uses an intact DNA copy for error-free repair of broken DNA. Besides DNA repair, HR also generates genetic diversity during sexual reproduction. Our research will be focused on Bloom’s syndrome helicase (BLM), a protein that restructures DNA molecules. BLM deficiency causes high cancer predisposition, highlighting its central role in HR regulation. Recently we discovered versatile complex DNA-restructuring activities of BLM. Based on these discoveries and our recently built equipment capacities, we are in a unique position to explore novel complex HR activities. In the proposed project we will, on one hand, determine unknown biochemical mechanisms of DNA processing in cutting-edge single-molecule manipulation experiments and, on the other hand, explore how these mechanisms enable DNA repair in live animals using the C. elegans worm as an animal model.
Final report
Results in Hungarian
Az élő szervezetek genomját folyamatos károsodás éri. A legveszélyesebb DNS-hiba a kettőstörés (double-strand break, DSB), ami genetikai instabilitáshoz és rákhoz vezethet. A DSB-k hibamentes javítása leghatékonyabban homológ rekombináció (HR) segítségével érhető el. A HR a DSB-javításon túlmenően – a meiózis során – a genetikai sokféleség létrehozásához és a kromoszóma-szegregáció megfelelő lezajlásához is elengedhetetlen. A RecQ-családba tartozó helikázok, köztük a humán Bloom-szindróma (BLM) helikáz, a HR központi motorjai és szabályozói. Ezek az enzimek széttekerik a DNS-szálakat és átalakítják a DNS-molekulák szerkezetét. Funkciókiesésük túlzott rekombinációt, magas rákhajlamot és felgyorsult öregedést okoz. A projekt során kidolgoztunk egy olyan módszert, amelynek segítségével az egyedi molekulák szintjén felderíthetővé vált a HR egyik legfontosabb, azonban mechanizmusában ismeretlen lépése, a DNS csomópont-migráció. Megvalósítottuk a vizsgálatokhoz szükséges egyedi műszerfejlesztéseket is. A projektben azt is felderítettük, hogy a csomópont-migráció és DNS-szerkezetátalakítás milyen események révén járul hozzá a DNS-javításhoz és a kromoszómák megfelelő szegregációjához élő állatban (C. elegans modellrendszerben).
Results in English
The genomes of living organisms are constantly exposed to damage. The most dangerous DNA lesions are double-strand breaks (DSBs), which can result in genomic instability and cancer. Error-free repair of DSBs can be achieved via homologous recombination (HR). Besides DSB repair, HR is also used to generate genetic diversity and ensure proper chromosome segregation during meiosis. RecQ-family helicases, including the human Bloom’s syndrome (BLM) helicase, are central engines and/or regulators of HR. These enzymes can unwind and restructure DNA molecules. Their deficiencies cause excessive recombination, high cancer predisposition and accelerated ageing. During the project, we have devised a novel method that enables the investigation – at the level of single molecules – of the mechanism of DNA branch migration, a key step of HR that was previously inaccessible for experiments. We have also performed the custom instrument development necessary for these investigations. We have also determined the mechanistic steps through which DNA junction migration and resolution complexes enable DNA repair and proper chromosome segregation in live animals using the C. elegans animal model system.
