Novel paracrine communication mechanisms in the tumor promoting activation of stromal fibroblasts in human colorectal cancer  Page description

Help  Print 
Back »
 

Details of project

  
Identifier
118018
Type NN
Principal investigator Wiener, Zoltán
Title in Hungarian A stromális fibroblasztok tumornövekedést elősegítő aktivációjában szerepet játszó új parakrin kommunikációs mechanizmusok vizsgálata humán vastagbélrákban
Title in English Novel paracrine communication mechanisms in the tumor promoting activation of stromal fibroblasts in human colorectal cancer
Keywords in Hungarian vastagbéltumor, intestinális adenoma, organoid, CRISPR-Cas9, exoszóma, extracelluláris vezikula, parakrin kommunikáció
Keywords in English intestine, colorectal cancer, intestinal adenoma, organoid, CRISPR-Cas9, exosome, extracellular vesicle, paracrine communication
Discipline
Cell biology and molecular transport mechanisms (Council of Medical and Biological Sciences)80 %
Cancer and its biological basis (Council of Medical and Biological Sciences)20 %
Panel Physiology, Pathophysiology, Pharmacology and Endocrinology
Department or equivalent Dept. of Genetics, Cell- and Immunobiology (Semmelweis University)
Participants Buzás, Edit Irén
Harsányi, László
Sódar, Barbara
Szalai, Csaba
Starting date 2016-05-01
Closing date 2020-12-31
Funding (in million HUF) 42.928
FTE (full time equivalent) 3.97
state closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
Jelen kutatási terv az egyik legsúlyosabb egészségügyi probléma, a vastag- és végbélrák (CRC) kialakulását vizsgálja, mely Magyarországon a rákos megbetegedések által okozott halálozási listán a második helyet foglalja el. A legújabb kutatások szerint az aktivált stromális fibroblasztok kritikus szereppel bírnak mind a CRC kezdeti lépéseiben, mind pedig progressziójában, a kedvezőtlen klinikai prognózisú betegeket azonosító génexpressziós mintázat pedig a stroma sejtjeire, nem pedig a tumor epithéliumra jellemzőek. A stroma tumorsejtek általi aktivációjának mechanizmusa azonban még nem tisztázott. Az exoszómák (EX), mikrovezikulák (MV), apoptotikus testek és nagy onkoszómák (LO), melyek összefoglaló néven extracelluláris vezikulákként (EV) ismertek, a sejtek közötti parakrin kommunikáció új módját testesítik meg; nemcsak méretben, hanem funkciójukat tekintve is jelentős különbségekkel rendelkeznek. A sejtek endoszomális kompartmentjéből származó EV alcsoport, az EX-ek jelentős terápiás célpontot képezhetnek. A projekt fő célkitűzése, hogy a CRC tumorsejtek által kibocsátott EX-ek fibroblasztokra kifejtett aktiváló hatását vizsgálja, valamint meghatározza annak mechanizmusát humán 3D organoidok használatával, mely a tumorokra jellemző sejt heterogenitást a 2D tenyészeteknél jobban reprezentálja. A kutatás prof. Kari Alitalo csoportjával (Helsinki) szoros bilaterális együttműködésben történik, és a közös előzetes eredményekre épül. A projekt ötvözi a tumorbiológia területén világszínvonalú eredményt elért Alitalo csoport tapasztalatát az EV-k nemzetközi szinten jelentős itthoni eredményeivel, valamint lehetőséget ad a felvett új kutatónak nemzetközi együttműködésre.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
A tumorok növekedésében és áttétképzésében központi szerepük van a tumor őssejteknek. A mikrokörnyezet, mint a stromális tumor-asszociált fibroblasztok (CAF), kitüntetett szereppel rendelkezik ennek a populációnak a fenntartásában. A kutatási terv hipotézise, hogy a CRC tumorsejtek aktívan indukálják a stromális fibroblasztok átalakulását EX-ek, vagy más EV populációk kibocsátásán keresztül. Minthogy az egér és humán vastagbéltumorok között jelentős eltérések figyelhetők meg, jelen projekt humán CRC modellek vizsgálatával foglalkozik.
1. A sejtek közötti új parakrin kommunikációs mechanizmusként meghatározzuk a vastagbél tumorsejtek által kibocsátott EX-ek jelentőségét a stromális fibroblasztok aktivációjában. Arra is kíváncsiak vagyunk, hogy a CRC első mutációs lépése, az Apc gén inaktivációja milyen hatással van az EX-ek termelésére és molekuláris összetételére, illetve az EX-ek által megvalósuló fibroblaszt aktivációra.
2. Együttműködő partnerünk segítségével azonosítunk olyan, az EX-ek által a fibroblasztokban indukált szekretált molekulákat, melyek visszacsatolási mechanizmus által a tumorsejteken hatnak, valamint meghatározzuk az EX-ek által aktivált jelátviteli utakat és azok funkcionális jelentőségét.
3. Együttműködő partnerünk olyan potenciális célmolekulákat vizsgál, melyek a CRC őssejtek fenntartásában kritikus szereppel rendelkeznek. Emellett a krónikus gyulladás is központi szerepet játszik az intestinális adenomák kezdeti kialakulásában, melyben a TNFα az egyik fő mediátor. Kutatásainkban meghatározzuk, hogy ezen molekulák az EX-ek jelenlétében szinergikus/antagonisztikus hatást fejtenek-e ki a stromális fibroblasztokban.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
A Kari Alitalo kutatócsoportja (Helsinki) és a Semmelweis Egyetem közötti együttműködés keretében megvalósuló projekt fő célja, hogy a CRC pathogenezisében részt vevő olyan új mechanizmusokat azonosítson, melyek potenciális terápiás célpontként funkcionálnak. A CRC előfordulási gyakorisága és magas halálozási rátája miatt a kutatás célja kiemelt jelentőségű. A legtöbb eddigi tanulmány a CRC sejtekből származó EX-ek RNS, lipid és fehérjeösszetételére fókuszált, 2D sejttenyészetek alkalmazásával. Minthogy a nemrég kifejlesztett 3D organoid technológia tenyésztési körülményei megtartják az in vivo tumorokra jellemző sejt heterogenitást, ezért a humán CRC vizsgálatára alkalmasabb módszert jelentenek. Kutatásaink során megvizsgáljuk az adenomából (Apc-mutáció hatására), valamint CRC-ből származó EX-ek biológiai jelentőségét, mint új parakrin sejtközötti kommunikációs tényező, a fibroblasztok tumornövekedést elősegítő aktivációjában. Meghatározzuk a hatásért felelős mechanizmust, valamint olyan molekulákat keresünk, melyek szinergikusan/antagonisztikusan hatnak az EX-ekkel. Azonosítjuk az EX-ek által a fibroblasztokban indukált, a tumorsejtekre visszaható szekretált molekulákat is. A kutatási tervben alkalmazott komplex megközelítés, mely egyesíti a Helsinki csoport CRC területen megszerzett tapasztalatát a Semmelweis Egyetem EV tudásával, olyan kiemelkedő tudományos eredményekhez vezethet, mely segít a tumorsejtek által előidézett fibroblaszt aktiváció pontosabb megértésében a vastagbéltumorok esetében. A vizsgálatokban a legmodernebb technológiát fémjelző 3D organoid tenyésztést kívánjuk kombinálni a genom célzott és specifikus módosítására alkalmas CRISPR-Cas9 módszerrel. Mivel az aktivált tumor-asszociált fibroblasztok központi szerepet játszanak a tumorőssejtek fennmaradásában fontos mikrokörnyezet kialakításában, mely sejtpopuláció a tumorellenes beavatkozások fő célpontjaként szolgál, ezért eredményeink a fibroblasztok átalakulását megakadályozó új terápiás lehetőségek kidolgozásában központi tudáshátteret biztosíthatnak.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
A vastag- és végbélrák (CRC) hazánkban a második helyen szerepel a tumorok által előidézett halálozási okok listáján évi kb. 5000 halálesettel, ezért kiemelt egészségügyi problémát jelent. A CRC tumor az epitheliális eredetű tumorsejtek mellett más sejteket is tartalmaz, melyeket együttesen stromának nevezünk. A stromának kitüntetett szerepe van a vastagbéltumorok kezdeti stádiumában, valamint rosszindulatú CRC-ré való átalakulásában, részben a tumor őssejtek számára a szükséges, lokális mikrokörnyezet kialakítása által. A tumor-őssejtpopuláció mérete pedig központi jelentőségű a tumorok növekedése, ismételt megjelenése, illetve klinikai kezelésekkel szembeni rezisztenciája szempontjából. A stroma tehát a jövőben új, elsődleges terápiás célpont lehet. Mindezek ellenére a tumorsejtek által indukált olyan mechanizmusok, melyek a stroma aktivációjához vezetnek CRC-ben, még kevéssé ismertek. A nemrég felfedezett extracelluláris vezikulák (EV) és azok legismertebb csoportja, az exoszómák (EX) membránnal körülvett hólyagocskák, melyeket a sejtek kibocsátanak és biológiailag aktív molekulákat közvetítenek a környező célsejtekhez, ezáltal a sejt-sejt kommunikáció új módját testesítik meg. A kutatási terv a tumorsejtekből származó EX-knek a stromális fibroblasztok aktivációjában betöltött szerepét vizsgálja a tumorigenezis adenoma és CRC stádiumaiban, a hatásért felelős mechanizmusokat kívánja azonosítani, valamint olyan további molekulákat keres, melyek ezt a hatást befolyásolják. Mindezek alapján a feltett tudományos kérdés kiemelkedő jelentőséggel bír, és az új, vastagbéltumort célzó terápiák fejlesztése számára alapvető biológiai háttértudást fog biztosítani.
Summary
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
This project will study one of the most important health-related issues, colorectal cancer (CRC) that is the second leading cause of cancer related mortality in Hungary. Recent studies have revealed that the activated stromal fibroblasts play a critical role in CRC initiation and progression. Gene signatures placing patients into a subgroup with unfavourable CRC disease outcome are characteristic for CRC stroma, and not for the tumor epithelium. However, how the tumor contributes to the activation of stromal fibroblasts in CRC, remains to be clarified. Extracellular vesicles (EVs) represent a novel paradigm in paracrine cell-cell communication; they include exosomes (EX), microvesicles (MV), apoptotic bodies and large oncosomes (LO) that differ from each other not only in their size distribution, but also in their functions. The endosomal compartment-derived EV subpopulation, the EXs provide promising therapeutic targets. The goal of this proposal is to identify the phenotypic changes that the intestinal tumor epithelium-derived EXs induce in fibroblasts and to determine the underlying mechanism by using the 3D organoid technology that better represents the cellular heterogeneity within the tumors compared to 2D cell cultures. The project will be carried out in close bilateral collaboration with prof. Kari Alitalo`s research group (Helsinki) and it is partially based on our common preliminary data. The project will combine the long-standing and world-leading expertise of the Alitalo group in the CRC field with the ongoing high-quality EV research at Budapest, Hungary and it will enable the new researcher to participate in international collaboration.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
The acquisition of the cancer stem cell phenotype that is primarily responsible for tumor growth and relapse, is defined by the microenvironment, including the stromal cancer-associated fibroblasts. In this proposal we hypothesize that CRC cells actively contribute to this tumor-promoting conversion of fibroblasts by releasing EXs or other subtypes of EVs. Since there are substantial differences between mouse and human intestinal cancers, we will focus on human CRC models.
1. We will determine the significance of the tumor epithelium-derived EXs, as novel intercellular paracrine communication, on the activation of the stromal fibroblasts in CRC. We will also study if the inactivating mutation in the Apc gene, the most common initial genetic alteration in intestinal tumorigenesis, results in changes of EX production and/or molecular composition as well as in EX-mediated fibroblast activation.
2. With our collaborator, we will identify secreted molecules that are induced by EXs in the stroma and that may act as feedback signal on the tumor epithelium. We will also determine the signal transduction pathways induced by tumor-derived EXs in fibroblasts and their significance.
3. We will identify molecules/pathways that display synergistic/antagonistic effects with EXs on the stromal fibroblasts. By bioinformatic and experimental approaches, our collaborator at Helsinki will determine further promising target molecules that may have a critical role in the maintenance of the CRC stem cells and we will test them. Since chronic inflammation is a key event in the initialization of intestinal adenomas via TNFα, we will determine the modifying effect of this molecule as well.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
This collaboration between the Alitalo group at Helsinki and the Semmelweis University intends to identify mechanisms involved in CRC pathogenesis that can serve as potential novel therapeutic targets, which is a compelling need based on the high incidence and malignancy of CRC. Most studies have so far determined the RNA, lipid or protein profiles of CRC cell-derived EXs only from 2D cell cultures. Since the recently developed organoid technology properly represents the cellular heterogeneity observed in tumors in vivo, it provides an improved model to study human CRC. This proposal will reveal the biological significance of intestinal adenoma (after Apc-mutation) and CRC epithelium-derived EXs, as a novel paracrine intercellular communication channel, in the tumor-initiated activation of the stromal fibroblasts. We will also study the underlying mechanism and critical factors that synergistically/antagonistically modify the effect of the EXs. Furthermore, we intend to identify soluble mediators that are released by the activated stromal fibroblasts upon the effect of EXs and provide a feedback on the tumor epithelium. This combined approach that builds bridges between the expertise in CRC at the University of Helsinki and in the EV field at the Semmelweis University, may result in cutting-edge scientific observations, leading to the better understanding of how the stroma is activated by tumor cells in CRC. Furthermore, it will implement the state-of-the-art 3D organoid culturing method in Hungary and will use the efficient genome editing CRISPR-Cas9 tool. Since the activated stromal fibroblasts critically contribute to the formation of the proper “niche” for CRC stem cells, the cell population that is the primary target of anti-tumor therapies, our results may contribute to the development of novel therapeutic options by targeting the conversion of the stromal fibroblasts to tumor-promoting cancer-associated fibroblasts.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
Colorectal cancer (CRC) is the second leading cause of cancer related mortality in Hungary with about 5,000 deaths yearly, thus representing a major health problem. The CRC tissue contains not only tumor cells of epithelial origin, but other supporting cells as well, known as the stroma. The stroma has a marked enhancing effect on the intestinal tumor initiation and conversion to malignant CRC, partly by establishing the local microenvironment for the maintenance and expansion of the CRC stem cells, the cell population responsible for tumor growth, relapse and resistance against clinical therapies. Thus, the stroma should be a primary target of the anti-cancer therapies. Despite the critical contribution of the stroma to CRC development, mechanisms by which the tumor cells actively initiate the conversion of the stroma is poorly known. The recently discovered extracellular vesicles (EV) and one of the EV subtypes with the most striking effects, the exosomes (EX), are small vesicles released by cells and they transport biologically active molecules to the neighboring cells, thus representing a novel cell-cell communication mechanism. This project aims at studying the effect of the tumor-derived EXs on the activation of the stroma in adenoma and CRC stages of tumorigenesis, to study the underlying mechanisms and to identify molecules whose production is induced by the tumor-derived EXs and that can be responsible for the tumor promoting effect of the stroma in CRC. Thus, the scientific question addressed by this proposal has an outstanding importance in understanding the biological background for developing novel anti-cancer clinical therapies in the future.




 

Final report

  
Results in Hungarian
Minthogy az extracelluláris vezikulák (EV) a cargo-jukat védett formában és koncentráltan szállítják, így a korai tumordiagnosztika ígéretes eszközei. A vastag- és végbélrák (CRC) a fejlett országokban az egyik leggyakoribb tumortípus. A CRC a rákos sejtek mellett stromális sejteket is tartalmaz, és a stromális fibroblasztok mennyisége rossz túléléssel párosul. Az APC mutáció az egyik első genetikai változás a betegek döntő többségében. A humán tumorok vizsgálatának egyik legmodernebb eszköze az organoid technológia, melynek alkalmazásával bizonyítottuk, hogy az Apc mutáció megemeli az EV kibocsátást. Bár a CRC sejtek EV-i nem aktiválták a fibroblasztokat, a fibroblaszt eredetű EV-k jelentősen megnövelték a CRC organoidok kolóniaképzését hipoxiában, epidermális növekedési faktor (EGF) jelenlétében. A fibroblasztok egyik legfontosabb aktivátoraként ismert TGFβ hatására a kibocsátott EV-k miRNS cargo-ja megváltozott. A fibroblaszt EV-k csak EGF-től függő CRC organoidokban serkentették a sejtek osztódását, melyet az általuk szállított, EGF családba tartozó amphiregulin közvetített. Ez a hatás nem függött sem a fibroblasztok tumor eredetétől, sem pedig a TGFβ-val való előkezeléstől. Eredményeink szerint tehát az APC mutáció központi szerepet játszik a tumorokban általánosan megfigyelt emelkedett EV kibocsátásban CRC esetében, valamint azonosítottunk egy új, fibroblaszt EV-k által szállított, amphiregulinhoz köthető mechanizmust, mely a CRC sejtek osztódásáért felelős.
Results in English
Since extracellular vesicles (EV) carry their cargo in a protected form, they hold a great potential for early cancer diagnosis. Colorectal cancer (CRC), one of the most common cancer types in the Western countries, is composed of both tumor and stromal cells. The amount of stromal fibroblasts negatively correlates with patient survival. APC mutation is one of the first genetic events in the majority of CRC patients. By applying organoids, representing a state-of-the-art approach for studying human CRC, we observed that Apc mutation critically induced EV release. Whereas there was no major effect of tumor cell-derived EVs on the activation of fibroblasts, we proved that fibroblast-derived EVs induced colony formation of CRC organoid cells under hypoxia. We also showed that fibroblasts released EVs with a characteristic miRNA cargo profile when stimulated with TGFβ, one of the most important activating factors of fibroblasts. Fibroblast EVs induced cell proliferation only in epidermal growth factor (EGF)-dependent patient-derived organoids by transmitting the EGF family member amphiregulin. This EV-induced cell proliferation did not depend on whether normal or cancer-associated fibroblasts were studied and it was independent of their pre-activation by TGFβ. Collectively, our data identified APC mutation as a critical factor inducing EV release and we suggest a novel mechanism for fibroblast-induced CRC cell proliferation, coupled to EV-associated amphiregulin.
Full text https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=118018
Decision
Yes





 

List of publications

  
Ádám Oszvald, Zsuzsanna Szvicsek, Márton Pápai, Andrea Kelemen, Zoltán Varga, Tamás Tölgyes, Kristóf Dede, Attila Bursics, Edit I Buzás and Zoltán Wiener: Fibroblast-derived extracellular vesicles induce colorectal cancer progression by transmitting amphiregulin, Front Cell Dev Biol. 2020 Jul 7;8:558. doi: 10.3389/fcell.2020.00558. eCollection 2020, 2020
Oszvald Ádám, Szvicsek Zsuzsanna, Sándor Gyöngyvér Orsolya, Kelemen Andrea, Soós András Áron, Pálóczi Krisztina, Bursics Attila, Dede Kristóf, Tölgyes Tamás, Buzás Edit I, Zeöld Anikó, Wiener Zoltán: Extracellular vesicles transmit epithelial growth factor activity in the intestinal stem cell niche., STEM CELLS 38: (2) pp. 291-300., 2020
Ádám Oszvald, Zsuzsanna Szvicsek, Márton Pápai, Andrea Kelemen, Zoltán Varga, Tamás Tölgyes, Kristóf Dede, Attila Bursics, Edit I Buzás and Zoltán Wiener: Fibroblast-derived extracellular vesicles induce colorectal cancer progression by transmitting amphiregulin, Frontiers in Cell and Developmental Biology, doi: 10.3389/fcell.2020.00558, in press, 2020
Szvicsek Zsuzsanna, Oszvald Ádám, Szabó Lili, Sándor Gyöngyvér Orsolya, Kelemen Andrea, Soós András Áron, Pálóczi Krisztina, Harsányi László, Tölgyes Tamás, Dede Kristóf, Bursics Attila, Buzás Edit I., Zeöld Anikó, Wiener Zoltán: Extracellular vesicle release from intestinal organoids is modulated by Apc mutation and other colorectal cancer progression factors, CELLULAR AND MOLECULAR LIFE SCIENCES 76(12):2463-2476, 2019
Kivelä R, Salmela I, Nguyen YH, Petrova TV, Koistinen HA, Wiener Z, Alitalo K: The transcription factor Prox1 is essential for satellite cell differentiation and muscle fibre-type regulation, NATURE COMMUNICATIONS 7: 13124, 2016
Szvicsek Zsuzsanna, Oszvald Ádám, Szabó Lili, Sándor Gyöngyvér Orsolya, Kelemen Andrea, Soós András Áron, Pálóczi Krisztina, Harsányi László, Tölgyes Tamás, Dede Kristóf, Bursics Attila, Buzás Edit I., Zeöld Anikó, Wiener Zoltán: Extracellular vesicle release from intestinal organoids is modulated by Apc mutation and other colorectal cancer progression factors, CELLULAR AND MOLECULAR LIFE SCIENCES in press: p. in press., 2019
Zsuzsanna Szvicsek, Ádám Oszvald, Andrea Kelemen, Attila Zaránd, László Harsányi, Edit Buzás and Zoltan Wiener: Characterizing the extracellular vesicle production of stromal fibroblasts in colorectal cancer, Annual Meeting 2017 of the International Society for Extracellular Vesicles, Toronto, Canada, 2017
Osteikoetxea X, Benke M, Rodriguez M, Paloczi K, Sodar BW, Szvicsek Z, Szabo-Taylor K, Vukman KV, Kittel A, Wiener Z, Vekey K, Harsanyi L, Szucs A, Turiak L, Buzas EI: Detection and proteomic characterization of extracellular vesicles in human pancreatic juice, BIOCHEM BIOPH RES CO 499: (1) pp. 37-43., 2018
Kivelä R, Salmela I, Nguyen YH, Petrova TV, Koistinen HA, Wiener Z, Alitalo K: The transcription factor Prox1 is essential for satellite cell differentiation and muscle fibre-type regulation, NAT COMMUN 7: Paper 13124. , 2016
Zsuzsanna Szvicsek, Adam Oszvald, Istvan Kovacs, Gyongyver Orsolya Sandor, Aniko Zeold, Andrea Kelemen, Edit Buzas, Zoltan Wiener: Characterizing the extracellular vesicle (EV) production of colorectal cancer cell lines, Annual Meeting 2018 of the International Society for Extracellular Vesicles, Barcelona, Spain, 2018
Lupsa N, Érsek B, Horváth A, Bencsik A, Lajkó E, Silló P, Oszvald Á, Wiener Z, Reményi P, Mikala G, Masszi T, Buzás EI, Pós Z: Skin-homing CD8+ T cells preferentially express GPI-anchored peptidase inhibitor 16, an inhibitor of cathepsin K, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30365157, 2018
Anikó Zeöld, Gyöngyvér Orsolya Sándor, Zsuzsanna Szvicsek, Andrea Kelemen, Ádám Oszvald, András Áron Soós, Zoltán Varga, Tamás Tölgyes, Kristóf Dede, Attila Bursics, Ákos Szűcs, László Harsányi, Edit Buzás, Zoltán Wiener: Tumor organoid models for studying extracellular vesicles, https://www.embo-embl-symposia.org/symposia/2018/EES18-08/, 2018



Back »