 |
The evolutionary limits of genomic transposon expansion in Escherichia coli, and its biotechnological implications
|
Help 
Print 
|
Here you can view and search the projects funded by NKFI since 2004
Back »
|
| |
Details of project |
|
|
| Identifier |
119298 |
| Type |
K |
| Principal investigator |
Fehér, Tamás |
| Title in Hungarian |
A genomi transzpozonszám-növekedés evolúciós korlátai Escherichia coli-ban, és ennek biotechnológiai vonatkozásai |
| Title in English |
The evolutionary limits of genomic transposon expansion in Escherichia coli, and its biotechnological implications |
| Keywords in Hungarian |
inszerciós szekvencia, prokarióta genom, anyagcseremérnökség, genommódosítás, géncsendesítés |
| Keywords in English |
insertion sequence, prokaryotic genome, metabolic engineering, genome editing, gene silencing |
| Discipline |
| General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences) | 40 % | | Genomics, comparative genomics, functional genomics (Council of Medical and Biological Sciences) | 40 % | | Microbiology: virology, bacteriology, parasitology, mycology (Council of Medical and Biological Sciences) | 20 % |
|
| Panel |
Genetics, Genomics, Bioinformatics and Systems Biology |
| Department or equivalent |
Institute of Biochemistry (HUN-REN Biological Research Centre Szeged) |
| Participants |
Ajibola, Walliyulahi
Dev, Ranti
Nyerges, Ákos
|
| Starting date |
2016-10-01 |
| Closing date |
2021-09-30 |
| Funding (in million HUF) |
40.542 |
| FTE (full time equivalent) |
4.50 |
| state |
closed project |
Summary in Hungarian A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
Szinte minden, napjainkban ismert genom tartalmaz mobilis genetikai elemeket, azaz helyváltozatásra képes DNS-szakaszokat. Az ilyen elemek, másnéven transzpozonok egy sejtben fellelhető kópiaszáma még közeli rokon fajok között is drámaian különbözhet. Ennek pontos oka máig ismeretlen; feltételezéseink szerint az adott kópiaszámot több tényező, úgymint a transzpozonok önszabályozása és szelekciós erők eredője határozza meg. A jelen munka ezeket a hatásokat kívánja feltárni a transzpozonok és gazdasejt közötti interakciók kísérletes vizsgálatával. Korábbi kutatásainkból tudjuk, hogy az Escherichia coli baktériumban már egyetlen transzpozon megjelenése is –a mutációs repertoár szélesítése révén- mérhetően emeli a sejt alkalmazkodóképességét. E fontos adatot most a másik véglet vizsgálatával egészítjük ki, azaz mesterségesen megnövelt transzpozonszám mellett kívánjuk mérni a genomi stabilitást, a sejt fitneszt és az evolvabilitást. Meg kívánjuk határozni a transzpozonszám felső korlátait E. coli-ban, illetve ennek a transzpozonok géntartalmától illetve környezeti hatásoktól való függését. Komplementer vizsgálatainkban megkíséreljük csendesíteni a bakteriális mobilis elemek transzkripcióját, majd meghatározni ennek hatását több biotechnológiailag is jelentős tényezőre, mint az ugrások gyakoriságára vagy a sejt adaptációs képességére. Ezt követően korszerű módszerek segítségével exogén anyagcsere-útvonalakat kódoló géneket kívánunk beültetni a coli-genomba, a transzpozonok mint integrációs célpontok felhasználásával. Végül anyagcsere-útvonalak genomi kópiaszám optimalizálásán keresztül mutatjuk be a transzpozonok egyik lehetséges biotechnológiai alkalmazását E. coli-ban.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
Munkánk három fő hipotézisen alapul: i) az Escherichia coli transzpozonszáma messze az elméleti maximum alatti, ii) a transzpozáz transzkripciójának csendesítésével a transzpozonok mobilitása csökkenthető, és iii) multigénes operonokat hordozó transzpozonok is képesek transzpozícióra.
Fő kérdéseink a következők:
1. Hiperaktív transzpozázok transz-ként adásával megemelhető-e bizonyos transzpozonfajták kópiaszáma?
2. A transpozáz-gén csendesítésével csökkenthető-e egyes transzpozonok ugrási gyakorisága?
3. A természetes szelekció önmagában képes-e limitálni a transzpozonok kópiaszámát E. coli-ban, és ha igen, milyen kópiaszámnál jelentkezik e limit?
4. Hogyan hat az emelt transzpozon kópiaszám a baktériumsejt genomi stabilitására, fitneszére és adaptációs képességére?
5. Hogyan hat a transzpozáz-csendesítés a baktériumsejt genomi stabilitására, fitneszére és adaptációs képességére?
6. Hogyan hat a transzpozonok géntartalma azok mobilitására és kópiaszámuk felső határára?
7. Felhasználhatók-e a transzpozonok integrációs célpontként hasznos genetikai konstrukciók genomba ültetésére?
8. Felhasználhatók-e a transzpozonok hasznos genetikai konstrukciók felsokszorozására?
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
Noha munkánk alapkutatás szempontjából a transzpozon-expanzió fitnesz-hatásait vizsgálja, fő értékét várhatóan az így szerzett információ és tapasztalat biotechnológiai alkalmazása fogja adni. Napjainkban ugyanis számos finomvegyszer előállítását ipari fermentorokban növesztett baktériumsejtek végzik. A laboratoriumban kifejlesztett törzsek ipari transzferét azonban számos jelenség nehezíti, melyek közül kiemelkedik a törzsek genetikai instabilitása. Első célunk ezért egy olyan portábilis genetikai konstrukció kifejlesztése, mellyel először válna lehetségessé különböző törzsekben a genetikai stabilitás növelése a transzpozázok átírásának csökkentésével. A stabilitás fokozásának másik módja a plazmidon összeszerelt, a hasznos vegyületek termeléséért felelős gének beültetése a genomba. Második célunk ezért az adott gének transzpozonokba integrálása, a legkorszerűbb genom-módosítási eljárások felhasználásával. Ez nemcsak nagyszámú integrációs célpontot biztosít, de egyben lehetővé teszi a beültetett gének –transzpozonok aktiválása révén történő- felsokszorozását is. Ez utóbbi eljárást ennek a munkának a keretén belül kifejlesztett hiperaktív transzpozázokkal végeznénk. További újítás lenne az optimális termelékenységű klónok a termelt vegyület biológiai aktivitásának segítségével történő kiválasztása.
Napjainkban kevés csoport foglalkozik bakteriális transzpozonokkal, vagy a transzpozonszám felső határainak vizsgálatával. A bakteriális törzsek biotechnológiai célú fejlesztése és a nagy-áteresztőképességű genommérnöki módszerek alkalmazása azonban rendkívűl népszerű témák, melyek területén a kapott eredmények különösen gyors publikációt igényelnek (Tyo et al., Nat. Biotechnol. 27:760; Ryu et al., Plos ONE 9: e94266; Gu et al., Sci. Rep. 5 : 9684). Ugyan ez mondható el a multigénes, vagy akár genomi léptékű génexpresszió-szabályozást alkalmazó kísérletekről (Qi & Arkin Nat. Rev. Microb. 12:341; Stevens & Carothers ACS Synth. Biol. 4:107; Si et al., Curr. Op. Biotechnol. 36:85). Ezek a tények már önmagukban is kiemelt figyelmet jósolnak a potenciális kutatási eredményeinknek, melyet új, azaz baktériumokban korábban még nem termeltetett vegyületek előállításával kívánunk fokozni.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
Az elmúlt évszázad egyik legmeglepőbb felfedezése volt annak igazolása, hogy bizonyos gének transzpozícióra, azaz helyváltoztatásra képesek a kromoszómán. Ezek a mobilis genetikai elemek, vagy transzpozonok több okból is igen fontosak. Evolúciós szempontból nézve például a transzpozonok ugrása mutációt okoz a kromoszómán, ami adott esetben segítheti a gazdasejt környezeti változásokhoz való alkalmazkodását. A legtöbb mutációs esemény azonban káros, ezért feltételezzük, hogy a transzpozonok egy adott sejtben igen nagy kópiaszámra való felszaporodását pontosan a természetes szelekció gátolhatja. E munka első része ezt a szelekciós határt vizsgálja úgy, hogy a transzpozonok ugrási-gyakoriságának megemelésével mesterségesen nagy kópiaszámot kísérel meg létrehozni egy baktériumsejtben. A munka második része a transzpozonok „megszelídítésével” foglalkozik. Napjainkban ugyanis számos értékes vegyületet állítanak elő ipari körülmények között növesztett baktériumsejtekkel. E sejtekben a spontán mutációk igen károsak lehetnek, mivel a termelői képesség elvesztéséhez vezethetnek. Ezért egy olyan, többféle sejtben is alkalmazható módszert kívánunk kifejleszteni, mely a transzpozonok ugrási gyakoriságát képes mérsékelni, és ezáltal a termelő törzsek stabilitását fokozni. Ezen túlmenően a transzpozonokat –beültetési célpontokként- a hasznos vegyületek termeléséért felelős gének beültetésére is fel kívánjuk használni. Végül a transzpozonok ugrásának jól szabályozható fokozásával az így beültetett hasznos gének megsokszorozását kívánjuk elérni a baktérium kromoszómáján, ezzel is fokozva az adott vegyület termelésének hatékonyságát.
| Summary Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
The majority of the genomes sequenced to date harbor transposable elements (TEs), DNA segments that can transpose from one locus to another. TEs seem to be molecular parasites co-evolving with the host, occasionally contributing to the evolution of the cell. Interestingly, the copy number of TEs per cell shows a dramatic variation, even among closely related phylogenies. What is the reason for this? Bacterial cells provide especially promising model systems to study the determinants of TE expansion in host genomes. Using such a model, we have recently shown that even a single TE can make a significant increase in the capacity of Escherichia coli to adapt to certain environmental changes by providing novel mutational mechanisms. The fundamental goal of the project is to investigate selective forces acting on TEs as a function of their copy number. More specifically, we will test the effect of artificial TE-enrichment on genome stability, cellular fitness and evolvability. The maximal transposon copy number and its dependence on the environmental factors, as well as on the genetic content of the mobile elements will be determined. As a complementary strategy, the silencing of transpositional activity will be attempted by inhibiting transposase transcription, and its effect on genome stability and evolvability will be investigated. Special attention will be paid to industrial applications: genomic co-integration of heterologous metabolic pathways will be carried out using TEs as insertion targets and amplification devices. This novel approach paves the way for stable, antibiotic-free, high-level production of industrially relevant added-value compounds using E. coli.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
In general, this project is centered on two questions that interrogate TEs from fundamental and applied scientific aspects: i) What is the mechanism of the copy number control of TEs, and what are the costs and benefits of harboring a set of TEs in the genome? ii) Can the multiplicity of TEs be exploited for turning the cell into a useful microbial cell factory?
Our work is based on three basic hypotheses: i) the copy number of transposable elements in Escherichia coli is far from the upper limit, ii) transcriptional silencing of the transposase genes reduces transpositional activity of the corresponding TEs, and iii) TEs carrying multigene-operons can be successfully mobilized .
The planned experiments address the following specific questions:
1. Can the copy number of certain TEs be dramatically increased using hyperactive transposase expression?
2. Can forces of selection alone limit the uncontrolled replicative transposition of a hyperactive TE? If yes, what is the limit of TE copy number in E. coli?
3. Can transposition frequencies be decreased via transcriptional silencing of the transposase genes?
4. How are genomic stability, cellular fitness and evolvability affected by an increase in TE copy number?
5. How are genomic stability, cellular fitness and evolvability affected by transposase-silencing?
6. How does the genetic content of TEs affect their mobility and upper limit of copy number?
7. Can TEs serve as targets for the insertion of useful genetic constructs into the genome?
8. Can TEs be used for the scalable amplification of useful genetic constructs?
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
Despite the fact that our fundamental question relates to the evolutionary benefits and disadvantages of TE-expansion in bacteria, the major impact of this work comes from its biotechnological implications. Namely, our studies explore the upper limits of bacterial genome engineering using repetitive elements. Importance to society is plentiful; metabolic engineering has brought about the microbial synthesis of hundreds of added value chemicals inside test-tube cultures. The transfer of such reprogrammed strains from the laboratory to the industry however, poses several hurdles. Of major importance is the implantation of the engineered plasmid-borne pathways into the chromosomal DNA of the host bacterium. This project offers a state-of-the-art procedure for multi-copy insertion of exogenous sequences into bacterial genomes without the need of repeated transformation and selection steps. The process is expandable with a further copy-number increase using hyperactive transposase genes, potentially limited only by the evolutionary barriers investigated in this study. In addition, we propose a strategy to improve genomic stability of engineered industrial strains through silencing transpositional activity at will, potentially applicable to a large variety of bacterial species.
Currently, experimental studies focusing on the evolutionary limits of TE-expansion are rare. High-throughput genome engineering for bacterial strain development is however, an extremely hot topic necessitating rapid action and publication (Tyo et al., Nat. Biotechnol. 27:760; Ryu et al., Plos ONE 9: e94266; Gu et al., Sci. Rep. 5 : 9684). The same can be said about the application of multi-gene silencing for biotechnological purposes (Qi & Arkin Nat. Rev. Microb. 12:341; Stevens & Carothers ACS Synth. Biol. 4:107; Si et al., Curr. Op. Biotechnol. 36:85). These facts alone warrant a respectable attention to our potential results obtained in this field. To increase impact further, we plan to demonstrate the feasibility of the system not only by producing a visually screenable compound, but also a novel added value chemical using high-throughput, bio-activity based screening.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
One of the most surprising discoveries of the past century was the observation that certain genes are capable of transposition, that is jumping from one position to the other on the chromosome. Such mobile elements, also called transposable elements (TEs) are important for multiple reasons. From the aspect of evolution, TEs contribute to the mutations arising in the genome and thereby facilitate adaptation of the host to environmental changes. Like all mutational events, transposition can have detrimental effects as well; therefore an extremely high copy-number of TEs within a cell is unlikely. The first part of this project investigates the evolutionary limits of TE-expansion within a bacterial genome by artificially increasing their copy-number, and inspecting the resulting effect on cellular fitness. The second part aims at controlling and exploiting TEs for biotechnological purposes. Today, hundreds of fine chemicals such as pharmaceuticals, hormones or food additives are made by genetically reprogrammed bacterial cells. Spontaneous mutations of the engineered genetic changes are highly unwanted, for they lead to loss of the industrially useful cellular functions. Our aim is to develop a simple way to silence TE-mobility within numerous existing biotechnologically useful bacterial strains. Using the most up to date techniques, we also wish to use TEs to aid the integration of the genetic constructs into the bacterial genome during the process of cellular reprogramming. Finally we wish to use mobile elements as vehicles to increase gene copy-number, and thereby improve productivity of industrially relevant bacterial strains.
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
List of publications |
|
|
| Ranti Dev Shukla, Ágnes Zvara, Ákos Avramucz, Alyona Biketova, Ákos Nyerges, László G. Puskás, Tamás Fehér: inPOSE: a flexible toolbox for chromosomal cloning and amplification of bacterial transgenes, BioRxiv MS ID: BIORXIV/2021/466346, 2021 | | Jelena Brkljacic, Bettina Wittler, Benson English Lindsey III, Veena Devi Ganeshan, Michael G. Sovic, Jason Niehaus, Walliyulahi Ajibola, Susanna M Bachle, Tamás Fehér*, David E. Somers*: Frequency, composition and mobility of Escherichia coli-derived transposable elements in holdings of plasmid repositories, Microbial Biotechnology, DOI: 10.1111/1751-7915.13962 (elfogadott cikk), 2021 | | Avramucz Akos, Moller-Olsen Christian, Grigonyte Aurelija M., Paramalingam Yanahan, Millard Andrew, Sagona Antonia P., Feher Tamas: Analysing Parallel Strategies to Alter the Host Specificity of Bacteriophage T7, BIOLOGY-BASEL 10: (6) 556, 2021 | | Széll Noémi, Fehér Tamás*, Maróti Zoltán, Kalmár Tibor, Latinovics Dóra, Nagy István, Orosz Zsuzsanna Z., Janáky Márta, Facskó Andrea, Sohajda Zoltán*: Myopia-26, the female-limited form of early-onset high myopia, occurring in a European family, ORPHANET JOURNAL OF RARE DISEASES 16: (1) 45, 2021 | | Ajibola Walliyulahi, Karcagi Ildiko, Somlyai Gabor, Somlyai Ildiko, Feher Tamas: Deuterium-depletion has no significant impact on the mutation rate of Escherichia coli, deuterium abundance therefore has a probabilistic, not deterministic effect on spontaneous mutagenesis, PLOS ONE 16: (3) e0243517, 2021 | | Nyerges Á., Bálint B., Cseklye J., Nagy I., Pál C., Fehér T.: CRISPR-interference-based modulation of mobile genetic elements in bacteria, Synthetic Biology (Oxf.), 4(1):ysz008, 2019 | | Kirtania Prithwiraj, Hódi Barbara, Mallick Ivy, Vass István Zoltan, Fehér Tamás, Vass Imre, Kós Peter B: A single plasmid based CRISPR interference in Synechocystis 6803 - A proof of concept., PLOS ONE 14: (11) e0225375, 2019 | | Ákos Nyerges, Balázs Bálint, Judit Cseklye, István Nagy, Csaba Pál and Tamás Fehér: CRISPR-based modulation of bacterial genome stability, CRISPRing – A New Beginning for the Genetic Improvement of Plants and Microbes (3-5 September 2018, Budapest, Hungary), 2018 | | Ranti Dev Shukla, Walliyulahi Ajibola, Ákos Avramucz, Ákos Nyerges, Tamás Fehér: Insertion sequence-mediated engineering of the Escherichia coli genome, Straub-days, (Szeged, Hungary, 10-11 May, 2018), 2018 | | Ranti Dev Shukla, Walliyulahi Ajibola, Ákos Avramucz, Ákos Nyerges, Tamás Fehér: Multi-copy transgene integration into the Escherichia coli chromosome for metabolic engineering, 5th International Synthetic & Systems Biology Summer School (Siena, Italy, 25-29 July, 2018), 2018 | | Nyerges Á., Bálint B., Cseklye J., Nagy I., Pál C., Fehér T.: CRISPR-interference-based modulation of mobile genetic elements in bacteria, Synthetic Biology (Oxf.), 4(1):ysz008, 2019 | | Christian Møller-Olsen, Siu Fung Stanley Ho, Ranti Dev Shukla, Tamas Feher, Antonia P. Sagona: Engineered K1F bacteriophages kill intracellular Escherichia coli K1 in human epithelial cells, Scientific Reports volume 8, Article number: 17559, 2018 | | Ranti Dev Shukla, Walliyulahi Ajibola, Ákos Avramucz, Ákos Nyerges, Tamás Fehér: Insertion sequence-mediated engineering of the Escherichia coli genome, Straub-days, (Szeged, Hungary, 10-11 May, 2018), 2018 | | Ranti Dev Shukla, Walliyulahi Ajibola, Ákos Avramucz, Ákos Nyerges, Tamás Fehér: Multi-copy transgene integration into the Escherichia coli chromosome for metabolic engineering, 5th International Synthetic & Systems Biology Summer School (Siena, Italy, 25-29 July, 2018), 2018 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
