osteoclasts, cell fusion, PLCγ2, transgenic mice, bone resorption
Discipline
Cell biology and molecular transport mechanisms (Council of Medical and Biological Sciences)
40 %
Signal transduction (Council of Medical and Biological Sciences)
30 %
Biological basis of immunity related disorders (e.g. autoimmunity) (Council of Medical and Biological Sciences)
30 %
Panel
Cellular and Developmental Biology
Department or equivalent
Dept. of Physiology (Semmelweis University)
Participants
Bajza, Boglárka Benkő, Péter Csete, Dániel Deli, Dorottya Farkas, János Győri, Dávid Kása, Orsolya Kovács, Eszter Boglárka Németh, Tamás Orosz, Anita Simon, Edina
Starting date
2016-10-01
Closing date
2021-09-30
Funding (in million HUF)
48.000
FTE (full time equivalent)
13.77
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. Az oszteoklasztok hatalmas csontbontó sejtek, amelyek elengedhetetlenek az egészséges és kóros csontlebontáshoz. A sejtek mieloid előalakokból először RANKL hatására preoszteoklasztokká fejlődnek, majd ezen sejtek fúziója révén jönnek létre az oszteoklasztokra jellemző többmagvú óriássejtek. Más kutatócsoportokkal együtt korábban kimutattuk, hogy a PLCγ2 foszfolipáz elengedhetetlen az oszteoklasztok fejlődéséhez és az oszteoklasztok általi csontlebontáshoz. Bár más munkacsoportok azt javasolták, hogy a PLCγ2 a RANKL-indukált biokémiai differenciációban vesz részt, mi nem találtunk eltérést az oszteoklasztokra specifikus gének expressziójában a PLCγ2-hiányos tenyészetekben. Ez arra utal, hogy a PLCγ2-nek az oszteoklaszt-fejlődés egy másik lépésében van szerepe. Előzetes eredményeink alapján feltételezzük, hogy a PLCγ2 a preoszteoklasztok fúziójához szükséges. A tervezett kísérletek célja ennek a vizsgálata kifinomult biokémiai, sejtbiológiai és mikroszkópos módszerekkel PLCγ2-hiányos egér oszteoklaszt tenyészeteken. Kísérleteink várhatóan az emlős szervezetek egészséges és kóros csontbontásának fontos új aspektusait fogják feltárni.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. A kutatás alapkérdése az oszteoklasztok általi csontbontás molekuláris mechanizmusa. A kísérletek konkrét célja a PLCγ2 foszfolipáz szerepének megértése. Bár a PLCγ2 elengedhetetlen az oszteoklasztok fejlődéséhez és működéséhez, szerepének molekuláris alapjai mindmáig nem tisztázottak. Saját eredményeink ellentmondanak annak az elképzelésnek, hogy a PLCγ2 az oszteoklasztokra jellemző génexpressziós változások létrejöttéhez szükséges. Szerintünk PLCγ2 a génexpressziós változások helyett elsősorban a biokémiailag már érett sejtek (preoszteoklasztok) fúziójában vehet részt. Mindezeket a kérdéseket kifinomult genetikai, biokémiai, sejtbiológiai és mikroszkópos módszerekkel fogjuk vizsgálni.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! Az oszteoklasztok központi szerepet játszanak az egészséges és kóros csontanyagcserében, különös tekintettel a csontritkulás, az ízületi gyulladásos megbetegedések és a csontbeli daganatok során kialakuló csontbontásra. A PLCγ2 az oszteoklasztok és ezáltal a csontbontás központi jelátvivő molekulája. A PLCγ2 emberi megbetegedésekben való szerepére utal, hogy a fehérje egyes funkció-nyerő mutációi gyulladásos betegségeket, többek közt ízületi érintettséggel járó gyulladást is eredményezhetnek. A PLCγ2 szerepének jobb megértése a kóros csontlebontással járó betegségek jobb megértéséhez, korai diagnózisához és esetleg új terápiás irányvonalak kijelöléséhez vezethet. A tervezett kísérletektől egyrészt a hazai kutatói közösség nemzetközi versenyképességének fokozása, másrészt a kóros csontbontással járó betegségek diagnosztikájának és terápiájának fejlesztése révén jelentős társadalmi hasznosulás várható.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. Az oszteoklasztok (csontfaló sejtek) hatalmas csontbontó sejtek, amelyek elengedhetetlenek az egészséges és kóros csontlebontáshoz. Fontos szerepük van a normális csontszerkezet kialakításában és fenntartásában, de számos betegségre, pl. a csontritkulásra, reumás ízületi gyulladásra vagy daganatos csontáttétre jellemző csontbontás kialakulásában is. Az oszteoklasztok a vérsejtekhez hasonló utakon fejlődnek, melynek első lépése egy biokémiai jellegű fejlődés, majd a későbbi időszakban a biokémiailag érett elő-oszteoklasztok egymással egyesülnek (fúzionálnak), így alakulnak ki a csontbontásra képes hatalmas óriássejtek, az oszteoklasztok. Más munkacsoportokkal együtt korábban kimutattuk, hogy a PLCγ2 nevű jelátviteli fehérje elengedhetetlen az oszteoklasztok fejlődéséhez. Mások azt feltételezték, hogy a PLCγ2 az oszteoklasztok érésének korai, biokémiai fejlődési fázisában vesz részt. Saját megfigyeléseink azonban ennek ellentmondtak, mivel a biokémiai fejlődés a PLCγ2 genetikai hiányában is létrejött. Ezért feltételezzük, hogy a PLCγ2 inkább egy későbbi fázisban (feltételezésünk szerint a sejtek fúziójában) játszik szerepet. A tervezett kísérletek célja ennek a hipotézisnek az ellenőrzése. A kísérletek során részletesen vizsgáljuk az oszteoklasztok fejlődésének számos különböző aspektusát PLCγ2-hiányos egerekből származó sejteken, vizsgáljuk más sejttípusok fúzióját, kidolgozunk egy új sejtfúzió-vizsgálati rendszert, és közvetlenül is vizsgáljuk a PLCγ2 szerepét a sejtfúzióban. Reményeink szerint a csontlebontás új molekuláris mechanizmusait fogjuk feltárni, ami a csontlebontással járó betegségek jobb megértését és új terápiás irányok kijelölését fogja lehetővé tenni.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. Osteoclasts are large bone-resorbing cells which are critical for physiological and pathological bone resorption. They develop from myeloid precursors through RANKL-induced differentiation to preosteoclasts followed by intercellular fusion to large multinucleated cells. We and others have previously shown that the PLCγ2 phospholipase is essential for osteoclast development and osteoclast-mediated bone resorption in mice. Though prior studies suggested that PLCγ2 is required for RANKL-induced biochemical differentiation, we observed normal osteoclast-specific gene expression in PLCγ2-deficient cultures, indicating that PLCγ2 is required for another step of osteoclast development. Based on our own preliminary studies, we hypothesize that PLCγ2 is required for preosteoclast fusion. The aim of the proposed experiments is to test that hypothesis using sophisticated biochemical, cell biological and microscopic analyses on PLCγ2-deficient mouse osteoclast cultures. Our studies are expected to reveal important novel aspects of the molecular mechanisms of normal and pathological bone resorption in mammalian organisms.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. The proposal addresses the molecular mechanism of osteoclast-mediated bone resorption. The aim of the proposed experiments is the understanding of the role of the PLCγ2 phospholipase in osteoclast development. Though PLCγ2 is indispensable for osteoclast development and function, the details of its specific role in osteoclasts is still poorly understood. Our own preliminary studies contradict the generally believed mechanism that PLCγ2 is required for osteoclast-specific gene expression changes. We hypothesize that PLCγ2 is rather involved in the cell-cell fusion process during later stages of osteoclast development. These questions will be addressed by sophisticated genetic, biochemical, cell biological and advanced microscopic techniques.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. Osteoclasts play a central role in physiological and pathological bone resorption, with special emphasis on bone loss during osteoporosis, rheumatoid arthritis and osteolytic tumors in the bone. PLCγ2 is a central component of osteoclast signaling and therefore of bone resorption. The role of PLCγ2 in human disease is indicated by the fact that certain gain-of-function mutations of PLCγ2 result in inflammatory diseases including joint inflammation. Understanding the role of PLCγ2 is expected to lead to better understanding of physiological and pathological bone resorption, and better diagnosis and novel therapeutic strategies of those diseases. The proposed experiments would increase the competitiveness of the Hungarian scientific community and it could lead to significant benefit to the society through better diagnosis and therapy of diseases characterized by excessive bone resorption.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. Osteoclasts are large bone-resorbing cells that are indispensable for physiological and pathological bone resorption. They play an important role in the development and maintenance of normal bone structure, but also in bone loss during several diseases such as osteoporosis, rheumatoid arthritis or bone-resorbing bone metastases. Osteoclasts develop from the same cellular lineage as white blood cells. The first phase of their development is characterized by biochemical differentiation to so-called preosteoclasts. This is then followed by the cell-cell fusion of preosteoclasts, leading to the emergence of large multinucleated osteoclasts capable of bone resorption. We and others have previously shown that the PLCγ2 intracellular signaling molecule is indispensable for osteoclast development. Others hypothesized that PLCγ2 plays a role in the early, biochemical differentiation phase leading to preosteoclast formation. However, our own experiments argue against that possibility, since biochemical differentiation occurred normally even in the absence of PLCγ2. Therefore, we hypothesized that PLCγ2 is critical for a later developmental stage, supposedly for the fusion of preosteoclasts to multinuclear osteoclasts. The proposed experiments aim to test this hypothesis. We will test various aspects of osteoclast development in detail on cells from PLCγ2-deficient mice, test the fusion of other cell types, develop a novel cell fusion assay and directly test the role of PLCγ2 in the fusion process. We hope that our experiments will reveal novel molecular mechanisms of bone resorption, leading to better understanding and potential new therapeutic strategies of those diseases.
Final report
Results in Hungarian
A projekt célja az oszteoklaszt-fejlődés új vizsgálómódszereinek a kidolgozása és a PLCγ2 jelátvivő fehérje oszteoklaszt-fejlődésben betöltött szerepének a vizsgálata volt. A projekt során beállítottuk az oszteoklasztok fejlődésének számos új, fluoreszcens színváltásra épülő vizsgálatát. Ezek lehetővé tették az oszteoklaszt-specifikus génexpressziónak és a preoszteoklasztok fúziójának a valós időben történő vizsgálatát. Ezen és további qPCR-alapú génexpressziós vizsgálatok segítségével kimutattuk, hogy a PLCγ2 feltehetően mind a génexpresszió, mind a sejtfúzió fázisában szerepet játszik. A projekt során számos további, a csontanyagcserével és a PLCγ2 szerepével kapcsolatos kísérletet végeztünk. Kondicionális géntörlés segítségével kimutattuk, hogy az oszteoklasztokban expresszálódó Syk tirozin-kináz fontos szerepet játszik az in vivo csontanyagcserében. Jellemeztük az Abcc6a szerepét az ektópiás kalcifikációban zebrahalakban. Kimutattuk a neutrofil granulocitákon belül expresszálódó PLCγ2 szerepét a rheumatoid arthritis állatmodelljében. Kimutattuk a PLCγ2 elengedhetetlen szerepét az autoantitest-indukált hólyagos bőrbetegségek kialakulásában. Kísérleteink jelentős új ismereteket eredményeztek az oszteoklasztok vizsgálatával és a PLCγ2-jelpálya szerepével kapcsolatban. Eredményeinket 7 Scimago Q1, köztük 3 Scimago D1 kategóriájú közleményben és számos további konferencia-kiadványban publikáltuk, döntő részben a témavezető utolsó szerzőségével.
Results in English
The aim of the project was to develop new methods to investigate osteoclast development and to test the role of the PLCγ2 signalling protein in osteoclast development. During the project, we established a number of new fluorescent color-conversion assays of osteoclast development. These have allowed the investigation of osteoclast-specific gene expression and preosteoclast fusion in real time. Using these and additional qPCR-based gene expression assays, we have shown that PLCγ2 is likely involved in both the gene expression and cell fusion phases. Several other experiments related to bone metabolism and the role of PLCγ2 have been performed throughout the project. Using conditional gene deletion, we have shown that the Syk tyrosine kinase expressed in osteoclasts plays an important role in in vivo bone metabolism. We characterized the role of Abcc6a in ectopic calcification in zebrafish. We demonstrated the role of PLCγ2 expressed within neutrophil granulocytes in an animal model of rheumatoid arthritis. We have demonstrated an essential role for PLCγ2 in the development of autoantibody-induced blistering skin diseases. Our experiments have led to significant new insights into the analysis of osteoclasts and the role of the PLCγ2 signaling pathway. Our results have been published in 7 Scimago Q1, including 3 Scimago D1, papers, and several additional conference proceedings, mostly with the principal investigator’s last authorship.
Futosi K, Kása O, Szilveszter KP and Mócsai A: Neutrophil phospholipase Cγ2 drives autoantibody-induced arthritis through the generation of the inflammatory microenvironment, Arthritis Rheumatol 2021 (in press), 2021
Czimer D, Porok K, Csete D, Gyüre Z, Lavró V, Fülöp K, Chen Z, Gyergyák H, Tusnády GE, Burgess SH, Mócsai A, Váradi A and Varga M: A new zebrafish model for Pseudoxanthoma elasticum (PXE), Front Cell Dev Biol 2021, 9: 628699, 2021
