 |
Beyond the dogma: quantitative biophysical analysis of the clustering of receptor tyrosine kinases and its effect on transmembrane signaling
|
Help 
Print 
|
Here you can view and search the projects funded by NKFI since 2004
Back »
|
| |
Details of project |
|
|
| Identifier |
120302 |
| Type |
K |
| Principal investigator |
Nagy, Péter |
| Title in Hungarian |
A dogmán túl: receptor tirozin kinázok klaszterizációjának és szignalizációjának kvantitatív biofizikai tanulmányozása |
| Title in English |
Beyond the dogma: quantitative biophysical analysis of the clustering of receptor tyrosine kinases and its effect on transmembrane signaling |
| Keywords in Hungarian |
EGF receptorcsalád, receptor klaszterizáció, transzmembrán jelátvitel, lipid környzet, daganat asszociált fibroblaszt |
| Keywords in English |
EGF receptor family, receptor clustering, transmembrane signaling, lipid environment, cancer-associated fibroblast |
| Discipline |
| Biophysics (e.g. transport mechanisms, bioenergetics, fluorescence) (Council of Medical and Biological Sciences) | 70 % | | Ortelius classification: Biophysics | | Cell biology and molecular transport mechanisms (Council of Medical and Biological Sciences) | 30 % |
|
| Panel |
Molecular and Structural Biology and Biochemistry |
| Department or equivalent |
Department of Biophysics and Cell Biology (University of Debrecen) |
| Participants |
Batta, Gyula
Hajdu, Tímea
Kovács, Tamás
Szabó, Ágnes Tímea
Váradi, Tímea Erzsébet
|
| Starting date |
2016-10-01 |
| Closing date |
2021-09-30 |
| Funding (in million HUF) |
47.988 |
| FTE (full time equivalent) |
11.16 |
| state |
closed project |
Summary in Hungarian A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
Bár a receptor tirozin kinázok dimerizációja és aktivációja közötti kapcsolat relatíve jól ismert, a receptorok klaszterizáció mediálta aktivációja finomhangolásának számtalan aspektusa nem feltárt. Érdeklődésünk homlokterében az epidermális növekedési faktor receptorcsalád (EGFR) áll (melyeket ErbB fehérjéknek is neveznek), valamint a lipid környezet és a sejt-sejt kommunikáció hatása arra, milyen módon kapcsolt a klaszterizáció a receptor aktivációhoz. A kutatási terv öt témából áll, melyek mindegyike a receptor tirozin kinázok aktivációja részleteinek megértését célozza. (1) Szeretnénk megérteni a plazmamembrán megváltozott lipidösszetételének hatását a transzmembrán receptorok biofizikai és sejtbiológiai tulajdonságaira egy lizoszómális tárolási betegséget használva modellrendszernek. (2-3) Szeretnénk kvantitatívan megmérni és modellezni az EGF receptorhoz való kötődését, valamint a receptorok ezt követő klaszterizációját és a szignál terjedését lokális stimulációt követően. (4) Mivel relatíve kevéssé ismert, hogy a daganatos stróma jelenlétében tenyésztett daganatsejtek megváltozott tulajdonságaiért mennyiben felelősek az ErbB fehérjék biofizikai tulajdonságai, össze szeretnénk hasonlítani ezen paramétereket daganat asszociált fibroblasztok jelenlétében és nélkülük tenyésztett tumor sejteken. (5) Mivel több, általunk alkalmazandó módszerhez szükséges a sejthez kötött antitestek jelölési arányának ismerete, meg fogjuk vizsgálni a fluoreszcens jelölés hatását az antitestek affinitására és kvantumhatásfokára, valamint olyan módszereket fogunk kifejleszteni, amelyek közvetlenül lehetővé teszik a kötött antitest frakció jelölési arányának meghatározását.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
Bár a receptor tirozin kinázok (RTK) ligand indukált aktivációjának alaplépései tisztázottak, a jelenség kvantitatív leírásában sok feloldatlan ellentmondás van. Azon egyszerű modell, mely szerint a ligand a dimerizáció kiváltásával aktiválja a receptort, a folyamat alaplépéseit megmagyarázza, de nem foglalja magába a ligand független és a nagyméretű klasztereket, valamint a lipid környezet hatását a receptorra. Hasonlóképpen hiányos és ellentmondásos az EGF kötődés kooperativitásának magyarázata. Ezért fogjuk megvizsgálni a RTK-ok és más membránfehérjék viselkedését a Gaucher betegség modelljében, amelyben a membrán lipidösszetétele átalakult, valamint meg fogjuk mérni az EGF kötődését különböző kísérleti körülmények között, amely lehetővé teszi a ligand kötődést és a receptor kölcsönhatásokat magába foglaló kvantitatív modell megalkotását (a kutatási terv 1. és 3. pontja). Mivel az aktivációs szignál lokális stimulációt követő terjedésének problémája ellentmondásos, megvizsgáljuk és kvantitatívan modellezzük ezt a jelenséget is (2. pont). Bár ismert, hogy a daganat stróma megváltoztatja a tumor sejteket, keveset tudunk arról, hogy ebben milyen szerepe van az ErbB receptorok klaszterizációjának. Ezért meg fogjuk vizsgálni az ErbB fehérjék klasztereit és jelátvitelét daganat asszociált fibroblasztok jelenlétében (4. pont). Bár valószínű, hogy a fluoreszcens festékek megváltoztatják az antitestek affinitását, meglepően kevés munka foglalkozott a sejthez kötött antitestek jelölési arányának meghatározásával, bár ez, és nem a törzsoldat jelölési aránya, fontos kvantitatív fluoreszcens mérésekben. Ezért meg fogjuk határozni ezt a paramétert a kutatási projekt során (5. pont).
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
Bár az ErbB receptorok jelátvitelét a klaszterizáció szabályozza, a folyamat első lépését, a ligand indukált dimerizációt, még nem írták le kvantitatívan. Az EGF egyensúlyi kötődésének mérése egy olyan modellt fog eredményezni, amely magába foglalja a ligand kötődés és a receptor interakciók tulajdonságait (Kd), valamint az ErbB1 (EGFR) és más ErbB fehérjék expressziós szintjének, a glikoziláció, az aktin hálózat és a kináz aktivitás hatását a folyamatra. Az EGF indukálta receptor dimerizáció így létrehozott globális modellje szükséges a folyamat molekuláris szintű megértéséhez. (3. pont). A kvantitatív modellek a szignalizáció membránban való terjedésével kapcsolatos ellentmondásokat is feloldhatják. Mivel ilyen modell még nem áll rendelkezésre, a szignálterjedés folyamatát részletesen vizsgálni és modellezni fogjuk (2. pont). Szintén vizsgálni fogjuk az ErbB és más membrán fehérjék biofizikai és sejtbiológiai tulajdonságait a Gaucher betegség sejtes modelljében, amelyben a plazmamembrán lipidösszetétele megváltozott (1. pont). Ezen kísérletek nemcsak a szfingolipidek membránfehérjék tulajdonságaira gyakorolt hatását fogják feltárni, de arra is rámutatnak, hogyan függhetnek össze a lizoszómális tárolási betegségek tünetei a plazmamembránban végbemenő változásokkal. Ha a membránfehérjék viselkedése valóban eltér a normálistól Gaucher betegségben, ez a betegség tüneteinek új kezelésének teremtheti meg a lehetőségét. A projekt következő fázisában az irodalomban fellelhető egy másik ellentmondás eredetét kívánjuk megvizsgálni. Bár a daganatsejtek in vivo kölcsönhatnak a strómával, in vitro rendszerint a stróma nélkül vizsgálják őket. A daganat asszociált fibroblasztokkal kölcsönható tumorsejteken található ErbB receptorok tulajdonságainak leírása nélkülözhetetlen az ErbB fehérjék által kiváltott daganatok patológiájának megértéséhez (4. pont). A fluoreszcens jelölés antitest affinitásra kifejtett hatásának és a sejthez kötött antitestfrakció jelölési arányának meghatározására kifejlesztendő új módszerek a kvantitatív biofizikai mérésekhez (pl. FRET, „number & brightness”) szükségesek, és a projekt 5. pontjában fogjuk azokat kidolgozni.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
A sejtek sokszor úgy válaszolnak az ingerekre, hogy a sejtmembránban elhelyezkedő receptoraik különböző növekedési faktorokat kötnek meg. Az egyik legelterjedtebb növekedési faktor, az epidermális növekedési faktor (EGF), egy monomer EGF receptorhoz kötődve váltja ki annak dimerizációját és aktivációját. Bár a folyamat alapvető lépéseit már leírták, egy olyan általános modell, amely megjósolná a sejtek EGF-re adott válaszát, még nem áll rendelkezésre. Egy ilyen modell különböző betegségekben (pl. daganatokban) használható, specifikus gyógyszerek kifejlesztését tenné lehetővé. Kutatásaink célja az EGF receptor viselkedésének részleteinek megértése, amelyek nélkülözhetetlenek egy ilyen modell megalkotásához. Meg szeretnénk vizsgálni a sejtmembrán megváltozott lipidösszetételének hatását a receptorok tulajdonságaira (pl. dimerizáció, laterális diffúzió, endocitózis), amelyek a jelátviteli folyamatok hatásosságát határozzák meg. Modellrendszerként egy örökletes betegséget, a Gaucher kórt fogjuk használni, így a betegség tüneteinek kialakulásába is betekintést nyerhetünk. Szintén meg fogjuk vizsgálni az EGF kötődését és a jelátviteli folyamat terjedését egyedi sejtekben különböző kísérleti körülmények között. Mivel mindkét folyamat függ a receptorok kölcsönhatásaitól, a kísérletek hozzájárulnak majd a rendszer viselkedését leíró modell megalkotásához. A kísérletekben gyakran elhanyagolják azt, hogy a daganatsejtek kötőszövetes környezetben tartózkodnak az emberi testben. Ezért az EGF receptor tulajdonságait olyan daganatsejtekben is vizsgálni fogjuk, amelyeket a daganatos kötőszövet egyik fontos komponensével, daganat asszociált fibroblasztokkal tenyésztünk együtt.
| Summary Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
Although the relationship between dimerization of receptor tyrosine kinases and their activation is relatively well known, there are many unresolved issues about the fine-tuning of clustering-induced activation of receptors. Our interest lies in the epidermal growth factor receptor (EGFR) family, also known as ErbB proteins, as well as in the influence of the lipid environment and cell-cell communication on how clustering is coupled to receptor activation. The research plan is divided into five topics which are aimed at understanding the subtleties of the activation of receptor tyrosine kinases. (1) We would like to understand the effect of altered lipid composition of the plasma membrane in a lysosomal storage disease on the biophysical and cell biological properties of transmembrane receptors. (2-3) We would like to quantitatively measure and model the binding of EGF to its receptor and the consequent clustering of receptors as well as the spread of the signal after local stimulation. (4) Since relatively little is known about how the altered behavior of cancer cells cocultured with the cancer stroma is related to changes in the biophysical properties of ErbB proteins, we would like to compare these parameters in cancer cells cultured in the presence or absence of cancer-associated fibroblasts. (5) Since many of the quantitative methods we intend to use require the knowledge of the number of fluorophores/antibody in the cell bound fraction, we will investigate the influence of fluorescence labeling on the affinity and quantum yield of antibodies and develop methods to measure the degree of labeling of the bound fraction directly.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
Although the basic mechanism of ligand-induced responses of receptor tyrosine kinases (RTK) is well known, important unresolved contradictions remain in its quantitative description. Although the simple model of ligand-induced dimerization explains the basic process of activation, it cannot account for large-scale and ligand-independent clusters, or for the effect of membrane lipids on receptor association and activation. Similarly, there is disagreement about the cooperativity of ligand binding to EGF receptor. Therefore, we will measure the behavior of RTKs and other membrane proteins in a model of Gaucher disease in which the lipid composition of the membrane is altered as well as the binding of EGF to its receptor under different experimental conditions allowing us to generate quantitative models involving ligand binding and receptor interactions (points 1 and 3 in the Research plan). Given the contradictions about the spread of activation after local stimulation with EGF we will not only measure this phenomenon under well-defined conditions, but quantitative models will also be generated (point 2). Although the cancer stroma influences tumor cells, little is known about its effect on receptor clustering prompting us to examine the clusters and signaling of ErbB proteins under the influence of cancer-associated fibroblasts (point 4). Although several findings point at the effect of fluorescent dyes on antibody affinity, surprisingly little work has been done to determine the degree of labeling (DOL) of bound antibodies, although this parameter, and not the DOL of the stock, is required for quantitative fluorescence measurements prompting us to determine it (point 5).
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
Although signaling of ErbB receptors is known to be driven by clustering, the first step, ligand-induced dimerization, has not been described quantitatively. Measurement and modelling of the equilibrium binding of EGF will reveal the properties (Kd) of ligand binding and dimerization, and the role of expression levels of ErbB1 (EGFR) and other ErbB proteins as well as the influence of glycosylation, the actin cytoskeleton and the activity of the kinase domain on EGF binding. In this way a global model of EGF-induced receptor dimerization can be created which is essential for understanding this process at the molecular level (point 3). Quantitative models could also resolve important contradictions about the spread of signaling in the membrane. Since such a model is not yet available, we plan to investigate and model this process in detail (point 2). We will also investigate the biophysical and cell biological properties of ErbB and other membrane proteins in a cellular model of Gaucher disease, in which the lipid content of the plasma membrane is altered (point 1). These experiments will not only reveal how sphingolipids alter the behavior of membrane proteins, but they will also shed light on how differences in the symptoms of lysosomal storage diseases might be related to alterations in the plasma membrane. If the behavior of membrane proteins is indeed altered in Gaucher disease, new ways for treating the symptoms of storage diseases can be developed. In the next stage of the project we plan to address another source of contradiction in the literature. While tumor cells interact with the cancer stroma in vivo, they are usually investigated in the absence of the stroma in vitro. Description of the behavior of ErbB receptors in cancer cells cocultured with cancer-associated fibroblasts is indispensable for understanding the pathology of cancers driven by overexpression of ErbB proteins (point 4). Development of a new method for determining the effect of fluorescence labeling on antibody affinity and for measuring the degree of labeling of the bound fraction of antibodies is required for quantitative biophysical measurements (e.g. FRET, number and brightness) which will be elaborated in point 5 of the project.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
Both healthy and cancerous cells usually respond to stimuli by binding different types of growth factors present in the plasma membrane. One of the most common growth factors, epidermal growth factor (EGF), binds to a monomeric EGF receptor leading to receptor dimerization and activation. Although the basic steps of this process are understood, a general model predicting the response of cells to EGF stimulus is not available. Such a model would make the development of more specific drugs against different diseases, including cancer, possible. Our research is aimed at elucidating the subtleties of EGF receptor signaling required for the creation of such a model. We plan to investigate the effects of an altered lipid composition of the plasma membrane on the biophysical and biological properties of the receptor (e.g. dimerization, lateral diffusion, endocytosis) which determine its signaling potency. We will use an inherited disease, Gaucher disease, as a model system providing more insight into the pathogenesis of this disease as well. We will also measure the binding of EGF to its receptor and the spread of signaling in single cells under different experimental conditions. Since both of these parameters depend on how the receptors interact with each other, these measurements will allow us to create a model describing the behavior of the system explained previously. The fact that cancer cells reside in connective tissue in the human body is often overlooked in experiments. Therefore, we will also measure the properties of EGF receptor in cancer cells cultured in the presence of cancer-associated fibroblasts, an important constituent of the cancer connective tissue.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
