Biophysics (e.g. transport mechanisms, bioenergetics, fluorescence) (Council of Medical and Biological Sciences)
100 %
Ortelius classification: Molecular biophysics
Panel
Molecular and Structural Biology and Biochemistry
Department or equivalent
Institute of Biophysics (HUN-REN Biological Research Centre Szeged)
Starting date
2016-10-01
Closing date
2020-09-30
Funding (in million HUF)
15.264
FTE (full time equivalent)
2.57
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. A kutatás fő célja a flavin-adenin-dinukleotid (FAD) és nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) koenzimek molekuláris szerkezetének jellemzése oldószerek tervezett sorozatában és enzimhez kötött formában. Erre a célra alkalmazott fő módszerünk a koenzimek – különösen széles tartományon, 50 fs és 10 ns között mért – autofluoreszcenciája kinetikai paramétereinek hozzárendelése különböző szerkezeti formákhoz. Ezt a kísérleti megközelítést kvantummechanikai/molekula mechanikai (QM/MM) számítások fogják kiegészíteni. A fenti elméleti és kísérleti módszerek együttese lehetővé teszi a legvalószínűbb konformációs szerkezetek meghatározását, ezek populációját és a szerkezetek közti átmenetek dinamikáját. Az oldószerek FAD koenzimre való korábban igazolt hatását a Hofmeister-hatásként ismert, a konformációs állapotok ionspecifikus befolyásolásának vizsgálata fogja kiegészíteni. NADH esetén feltérképezzük annak kevésbé meghatározott fluoreszcencia kinetikáját, majd szintén vizsgáljuk a Hofmeister-hatást. Egy következő szakaszban a natív és megfelelően pont-mutált flavocitokróm C szulfid dehidrogenáz (FCC) enzimhez kötött FAD fluoreszcencia kinetikáját tanulmányozzuk. Feltevésünk szerint ez a megközelítés elvezet az enzim funkcionális elektrontranszportjának lépésről lépesre való felderítéséhez.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. A kutatás első alapkérdése, hogy a koenzimeken lezajló Hofmeister effektus hogyan jellemezhető és modellezhető. Előnyös viszonylag kis molekulákon vizsgálni ezt a nagy fontosságú biológiai hatást, mert ezeken QM/MM számítások könnyedén végrehajthatók. Feltéve, hogy a megfelelő Hofmeister-sók szabályozó szerepe a fluoreszcencia kinetikákon és a modellszámításokban is megfigyelhető, az utóbbi várhatóan fiziko-kémiai részletekkel szolgálhat a Hofmeister-hatás mögött álló (szub)molekuláris folyamatokról. A második alapkérdés a kovalensen kötött FAD szerepe az FCC elektrontranszport láncában. Feltevésünk, hogy azonosíthatjuk ezen enzim különböző funkcionális csoportjait, megfigyelve a FAD fluoreszcencia kinetikáját, és ezáltal közvetlen környezetével való kölcsönhatását natív és mutáns FCC-ben. A kinetikák elemzésére hatékony matematikai módszerünket alkalmazva pontosan és érzékenyen meg tudjuk figyelni az egyes pontmutációk okozta szerkezetváltozásokat. Optimális esetben a módszer hozzájárulhat az elektrontranszport lánc részletesebb modelljéhez.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! Az elérni kívánt eredmények alapvetően hozzájárulhatnak a Hofmeister-hatás hátterének fiziko-kémiai szinten való megértéséhez. Az FCC tanulmányozására alkalmazott módszer sikeressége esetén az más FAD és/vagy NADH megkötő enzimek vagy makromolekulák vizsgálatára is kiterjeszthető, lehetővé téve hatékony szerkezeti és működési vizsgálatukat. Ez az ismeret új funkcionális anyagok, esetleg terápiás molekulák kifejlesztéséhez vezethet. A pályázat erőssége, hogy Magyarországon és a tágabb régióban is a Femtobiológia Kutatócsoportnál áll egyedül rendelkezésre olyan fluoreszcencia spektroszkópiai mérőberendezés, mellyel a rövid (fs, ps) és hosszú (ns) időtartományban is egyszerre végezhetők mérések, ami a kitűzött célok végrehajtásához elengedhetetlen. A szakember állomány egyedülálló a mérőberendezés és az eredmények elemzéséhez szükséges matematikai módszerek fejlesztése és karbantartása szempontjából. A szükséges minták előállítását a kísérleti eredményekhez igazodva a Biokatalízis a Bioüzemanyagok és a Bioremediáció Területén Kutatócsoport munkatársai végzik a Femtobiológia Kutatócsoport kutatóival szoros együttműködésben.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. A molekulaszerkezeti kutatások különösen nagyméretű részecskéken, mint pl. az élettani folyamatokban döntő hatással bíró fehérjék elég nehézkesek. Jelen kutatás célja, hogy a környezetnek a molekulaszerkezetre gyakorolt hatását időbontott fluoreszcencia spektroszkópia segítségével előbb kis részecskéken, koenzimeken vizsgálja meg. A fluoreszcencia életidő lecsengésének matematikai elemzése információt szolgáltat a molekula szerkezetéről és az abban esetlegesen létrejött változásokról. Kis molekulák esetén a kísérleti eredményeket molekuladinamikai számításokkal lehet összehasonlítani és érvényesíteni. A natív és pont-mutált flavocitokróm C szulfid dehidrogenáz (FCC) enzimet tanulmányozva, mely kovalensen köti ezen a kis fluoreszcens koenzimek egyikét, megfigyelhető az egyes alcsoportok szerepe, így feltérképezhető ennek a molekulának például a biohidrogén üzemanyag termelésében való használhatósága.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. The main goal of the proposed project is to characterize the molecular structures of coenzymes flavin adenine dinucleotide (FAD) and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), both in a planned sequence of solutions and in enzyme-bound forms. The main method to be applied for this purposes is mapping the different kinetical parameters taking place in the autofluorescence of the coenzymes – detected in an unusual wide range from 50 fs to 10 ns – to a set of different structures. This experimental approach will be extended by quantum mechanical/molecular mechanical (QM/MM) calculations. The above combination of experimental and theoretical methods makes possible the determination of the most probable conformational structures, their populations and the dynamics of the transitions among these structures. The previously demonstrated effect of solvents on FAD will be now fulfilled for the study of the ion specific controlling of the conformational states, known as Hofmeister effect. For NADH, we will first explore its less specified fluorescence kinetics and then also perform a study on the Hofmeister effect. In a next phase we plan to monitor the fluorescence kinetics of FAD bound to the native and properly designed point-mutated forms of flavocytochrome C sulfide dehydrogenase (FCC). According to our hypothesis this approach will lead to a step-by-step uncovering the route of the functional electron transport in this enzyme.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. The first fundamental question of the present proposal is how the Hofmeister effect taking place on the coenzymes can be characterized and modelled. The advantage of studying this effect of high biological importance on these relatively small molecules is the feasibility of executing QM/MM calculations on them. Provided that the controlling roles of the proper Hofmeister salts is observable both in the fluorescence kinetics and the model calculation, the latter is expected to provide physico-chemical details revealing the (sub)molecular mechanisms behind the Hofmeister effect. The second fundamental question is the functional role of covalently bound FAD in the electron transport chain of FCC. Our hypothesis is that monitoring the fluorescence kinetics and thus the interactions of FAD with its close vicinity in native and mutant FCC, we can identify different functional groups of this enzyme. By the application of our sophisticated mathematical method for the analysis of the kinetics we can monitor very sensitively and precisely the structural changes caused by the different point mutations. Optimally, this procedure will contribute to a more detailed model of the electron transport chain.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. The expected results can have a fundamental contribution for understanding the backgrounds of the Hofmeister effect at physico-chemical level. If they are successful, the methods applied in the study of FCC can be extended to other enzymes or macromolecules binding coenzymes FAD/NADH, which can be very effective in understanding their structures and functions. The knowledge obtained can lead to the development of new functional or even therapeutic molecules. The strong point of present proposal is that in Hungary and even in the broader region only at the Femtobiology Research Group exists a fluorescence spectroscopy setup which can measure both in the short (fs, ps) and the long (ns) time scale simultaneously, which is an absolute necessity for carrying out its goals. The group of experts is unique in developing and maintaining the measuring setup and the corresponding mathematical methods for the analysis of the results. The staff of the Biocatalysis for Biofuels and Bioremediation Research Group work closely with the researchers of the Femtobiology Research Group and develop the needed samples according to the experimental results.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. Molecular structure studies on large molecules like polypeptides of crucial functions in physiological processes are relatively hard. The aim of this research is to study the effect of the environment on the molecular structure applying time-resolved fluorescence spectroscopy first on small molecules, like coenzymes. The mathematical analysis of the fluorescence decay kinetics provides information on the structure of these molecules, as well as on the eventual changes in them. For these small molecules the experimental results can be compared and validated with molecular dynamics calculations. Studying the native and point-mutated forms of flavocytochrome C sulfide dehydrogenase (FCC) enzyme which covalently binds one of these small fluorescent coenzymes, one can monitor the role of different subgroups, thus exploring the potential use of this molecule in the production of biohidrogen fuel.
Final report
Results in Hungarian
A projekt során flavin-adenin-dinukleotid (FAD) és nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) koenzimek molekuláris szerkezetének jellemzésére kísérleteket végeztünk ezen molekulák 50 fs és 10 ns között mért autofluoreszcenciája kinetikai paramétereinek meghatározására és ezek hozzárendelésére különböző konformációkhoz. A kísérleti mérések elemzését újonnan kidolgozott matematikai módszerrel végeztük, mely ötvözi a gépi tanulás és optimalizálás módszereit. Az elvégzett molekula mechanikai számítások jó egyezést mutatnak a kísérleti eredmények matematikai értelmezésével.
Results in English
During the project we performed experiments to characterize the molecular structures of coenzymes flavin adenine dinucleotide (FAD) and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) with mapping the different kinetical parameters taking place in the autofluorescence of the coenzymes detected in an unusual wide range from 50 fs to 10 ns and to compare these to a set of different structures The experimental data were analyzed with a newly developed mathematical method combining machine learning and optimization. The molecular mechanical calculations are in good agreement with the results of the mathematical analysis of the experimental data.
Ferenc Sarlós, Zoltán Násztor, Áron Sipos, János Horváth, Rita Nagypál, András Dér, Géza I. Groma: Hofmeister effect on coenzyme FAD revealed by ultrafast fluorescence kinetics and molecular dynamics simulation, előadás, 2017
