Molecular and cellular neuroscience (Council of Medical and Biological Sciences)
100 %
Ortelius classification: Neurobiology
Panel
Neurosciences
Department or equivalent
Laboratory of Cellular Neurophysiology (Institute of Experimental Medicine)
Participants
Holderith, Noémi Kis, Viktor Lőrincz, Andrea Sümegi, Máté Gergely
Starting date
2017-09-01
Closing date
2017-12-31
Funding (in million HUF)
12.285
FTE (full time equivalent)
0.56
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. Az emberi agy kimagasló kognitív képességét az őt felépítő idegsejtek és a köztük kialakult szinapszisok funkcionális sokféleségének, valamint az ezekből felépülő hálózat komplex működésének köszönheti. Az elmúlt fél évszázad kutatásai a különböző idegsejtek közötti szinapszisok méretének, alakjának és funkcionális tulajdonságainak széles skáláját tárták fel, melyek mögött számos eltérő molekuláris mechanizmust sikerült azonosítani. Funkcionálisan eltérő szinapszisok azonban kialakulnak morfológiailag és funkcionálisan azonos idegsejtek közötti kapcsolatok esetében is. A mi munkahipotézisünk az, hogy ennek a funkcionális diverzitásnak az alapja a szinapszisokat felépítő molekuláris háló egyes elemeinek mennyiségi eltérése. Munkánk során egy ilyen, nagy molekuláris és funkcionális variabilitást mutató kapcsolatot vizsgálunk, melyet a hippokampális CA1 régió piramissejtjei létesítenek mGluR1α–t kifejező gátló idegsejteken. A szinapszisok biofizikai paramétereit több sejtből szinkron in vitro patch-clamp elektrofiziológiai mérésekkel, majd ezt követően ún. multiple probability fluctuation analízis segítségével határozzuk meg. Az egyes szinapszisok molekuláris összetevőit a jelenleg fejlesztési stádiumban lévő ún. postembedding fluoreszcens immunlokalizációs technikával tervezzük meghatározni ultravékony metszeteken. Eredményeink alapján rekonstruálni fogjuk a különböző funkcionális karakterisztikával rendelkező szinapszisok molekuláris ujjlenyomatát, melynek segítségével szinapszisok millióihoz fogunk tudni funkcionális paramétereket társítani, amikor ún. array tomográfia segítségével elkészül majd a hippokampusz idegsejtjeinek kapcsolati térképe.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. Hipotézisünk szerint morfológiailag és molekulárisan homogén sejtcsoportok között létrejött szinapszisok funkcionális heterogenitását az őket felépítő molekuláris háló egyes elemeinek mennyiségi eltérése okozza. A pályázat fő célja, hogy azonosítsuk az eltérő biofizikai tulajdonságokkal rendelkező hippokampális serkentő szinapszisok molekuláris ujjlenyomatát.
Részletes célok: a1 Feltérképezni a hippokampális serkentő szinapszis populációban a funkcionális paraméterek variabilitását. a1.1: Mekkora a variabilitás a hippokampális CA1 piramissejtek és mGluR1α+ O-LM típusú gátló sejtek szinapszisai biofizikai paramétereiben? a1.2: A variabilitás pre- vagy posztszinaptikus eredetű? a1.3: A pre- és posztszinaptikus funkcionális tulajdonságok korrelálnak-e?
a2 Új, nagy felbontású módszer kifejlesztése mely lehetővé teszi a funkcionálisan jellemzett szinapszisok kvantitatív molekuláris vizsgálatát. a2.1: Melyik preparátum a legalkalmasabb nagyszámú szinaptikus fehérje hatékony szekvenciális detektálására? a2.2: Melyik elúciós eljárás a legalkalmasabb arra, hogy a jelölést követően az ellenanyagokat úgy tudjuk eltávolítani a preparátumról, hogy az ne tegye tönkre a további immunjelölések hatékonyságát? a2.3: Milyen módszerrel lehet leghatékonyabban kvantitatív analízisre alkalmas felvételt készíteni az immunreakciókról?
a3 Biofizikai és molekuláris tulajdonságok közötti kapcsolatok feltérképezése egyedi szinapszisokban. a3.1: Hány szinaptikus fehérje mennyisége korrelál egy adott funkcionális tulajdonsággal? a3.2: Van-e ezek között egy vagy néhány olyan kitüntetett fehérje, melynek a mennyisége alapvetően meghatározza az adott funkcionális tulajdonságot?
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! A javasolt kísérletek eredményei nagymértékben hozzájárulnak ahhoz, hogy megértsük az agykérgi szinaptikus kommunikáció működési alapelveit. Célunk, hogy meghatározzuk, hogy a preszinaptikus feszültségfüggő Ca2+ csatornák, a szinaptikus vezikulák felszabadulásában kulcsszerepet játszó fehérje-komplexek, a posztszinaptikus receptorok és azok járulékos alegységei mennyiségében mérhető kvantitatív különbségek milyen módon járulnak hozzá a hippokampális szinapszisok funkcionális diverzitásához. A funkcionális különbségek kvantitatív molekuláris ujjlenyomatainak azonosításával szinapszisok millióihoz fogunk tudni funkcionális paramétereket társítani, amikor az ún. array tomográfia segítségével elkészül majd a hippokampusz idegsejtjeinek kapcsolódási térképe (connectome). Továbbá egészséges rágcsálókon kapott eredményeink összehasonlítási alapul fognak szolgálni egyes neurodegeneratív és pszichiátriai betegségek állatmodelljeiben kapott eredményekhez. Laboratóriumunkat a világ vezető laboratóriumai között tartják számon szinapszisok molekuláris, morfológiai és funkcionális elemzése terén. A mostani pályázat keretében egy kritikus technikai előrelépést valósítanánk meg a szinapszisok egyedi szinten történő proteomikai és funkcionális analízisével. Tudomásunk szerint a molekuláris neuroanatómiai kísérletek hasonló színvonalú vizsgálata csupán néhány más nemzetközi kutatócsoportban folyik, de ezek a laboratóriumok nem rendelkeznek a szinapszisok megfelelő szintű funkcionális jellemzéséhez szükséges feltételekkel és szakértelemmel.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. Az emberi agy kimagasló kognitív képessége az őt felépítő idegsejtek kapcsolati hálójának komplexitásában rejlik. Az idegsejtek és az általuk kialakított kapcsolatok nagymértékű változatosságának köszönhetjük, hogy olyan bonyolult számítási feladatot igénylő folyamatok kivitelezésére vagyunk képesek, mint az érzékelés, a koordinált mozgás vagy az információk rögzítése memória formájában és annak újra felidézése. A pályázatunk fő célja, hogy megértsük, hogy a szinaptikus kapcsolatok molekuláris változatossága hogyan járul hozzá a szinapszisok működésében észlelt sokszínűséghez. Ennek érdekében ismert idegsejtpárok kapcsolatait fogjuk vizsgálni egyszerre funkcionális, molekuláris és nagy feloldású képalkotó módszerekkel. Ez a kombinált eljárás új technológiai fejlesztést igényel, mivel egyetlen jelenlegi lokalizációs technológia sem biztosítja a kellő mértékű felbontás melletti hatékony detekciót.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. Our astonishing cognitive abilities are the consequence of complex connectivity within our neuronal networks and the large functional diversity of excitable nerve cells and their synapses. Investigations over the past half a century revealed dramatic diversity in shape, size and functional properties among synapses established by distinct cell types in different brain regions and demonstrated that the functional differences are partly due to different molecular mechanisms. However, synaptic diversity is also observed among synapses established by molecularly and morphologically uniform presynaptic cells on molecularly and morphologically uniform postsynaptic cells. Our hypothesis is that quantitative molecular differences underlie the functional diversity of such synapses. We will focus on hippocampal CA1 pyramidal cell (PC) to somatostatin/mGluR1α expressing O-LM cell synapses, which show remarkable functional heterogeneity. In vitro multiple whole cell patch-clamp recordings followed by quantal analysis will be performed to quantify well-defined biophysical properties of these synapses. The molecular composition of the functionally characterized individual synapses will be determined following the development of a novel immunolocalization method. Our results will reveal quantitative molecular fingerprints of functional properties, allowing us to render dynamic behaviour to billions of synapses when the connectome of the hippocampal circuit is created using array tomographic reconstructions.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. Our hypothesis is that quantitative molecular differences underlie the functional diversity of synapses made by molecularly and morphologically homogeneous pre- and postsynaptic neurons. The general aim of the proposal is to identify molecular fingerprints defining key biophysical properties of hippocampal glutamatergic synapses. Specific aims: a1 To identify the variability in the functional properties of homogeneous populations of glutamatergic synapses. a1.1: How large is the variability in defined biophysical properties among synapses established by CA1 PCs on mGluR1α+ O-LM cells? a1.2: What is the main source of variance (pre- or postsynaptic)? a1.3: Are there correlations between pre- and postsynaptic functional properties of the characterized synapses?
a2 To develop a high-resolution method that allows quantitative molecular analysis of functionally characterized synapses. a2.1: What is the most ideal tissue preparation that allows the localization of a large number of synaptic proteins? a2.2: What is the most ideal way of eluting antibodies that preserves the antigenicity of molecules for repeated re-immunolabelling? a2.3: What is the best way of quantifying the immunofluorescent signal in individual synapses? a2.4: Which pre- and postsynaptic proteins can be specifically localized using our novel method?
a3 To investigate the relationship between the biophysical properties of, and the amounts of synaptic molecules at, individual synapses. a3.1: How many molecules will correlate with a given biophysical property? a3.2: Is there a dominant molecule the quantity of which primarily defines a certain biophysical property?
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. The results of the proposed experiments will provide a major contribution to our understanding of the mechanisms of synaptic communication in cortical networks. We will determine how quantitative differences in presynaptic Ca2+ channels and release machinery proteins, together with postsynaptic neurotransmitter receptors and their accessory subunits, underlie the functional diversity of hippocampal synapses. Identifying quantitative molecular fingerprints of functional properties will allow us to render dynamic functions to billions of synapses when the connectome of the hippocampal circuit is created using array tomographic reconstructions. In addition, our results obtained from healthy rodents could serve as the foundation of comparisons to those obtained in animal models of neurodegenerative and psychological disorders. Our laboratory is recognized as a world leader in analyzing molecular, structural and functional aspects of central synapses using combined electrophysiological, imaging and ultrastructural approaches. Here, we propose a major technical advance by performing proteomic analysis of functionally characterized individual synapses. We are aware of very few international laboratories who are capable of performing the molecular neuroanatomical experiments at the same standard, but none of them can perform the functional analysis of the synapses at the required details. Thus, the combination of these two cutting edge technologies is the major strength of our proposal, placing it in a unique position.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. Our astonishing cognitive abilities are the consequence of the complex connectivity between the nerve cells of our brain. Nerve cells and their synaptic contacts are also highly variable, that is why our nervous system is capable of performing very different computations like sensation, coordinated movement or formation and retrieval of memories. The major aim of the present proposal is to understand the molecular differences among synapses that cause the large functional diversity. To achieve this, individual synapses established between well-defined nerve cells will be functionally characterized and the molecular content of the very same synapses will be determined. This combined functional-molecular approach requires the development of new technologies, as none of the currently available localization methods is sufficient to accomplish the task.
Final report
Results in Hungarian
A pályázat 2017.09.01-én indult és a pályázó kérésére 2017.12.31-én lezárásra került.
A pályázat fő hipotézise, hogy a hippokampális szinapszisok funkcionális sokszínűségéért molekuláris különbségek felelősek. A pályázat 3 specifikus célt tartalmazott, melyek közül az első két cél eléréséhez számos kísérletet végeztünk már az első 3 hónap alatt.
Az első cél, a szinapszisok funkcionális heterogenitásának kvantitatív jellemzése volt. Ezen cél elérésé érdekében páros whole-cell patch-clamp elvezetéseket végeztünk hippokampális piramissejtek és úgynevezett O-LM sejtek között. Eredményeink már az első pár hónapban megmutatták, hogy az O-LM sejteken kiváltott posztszinaptikus válaszok (EPSC) hatalmas variabilitást mutatnak, mind a nagyságukban (amplitúdó) és a rövidtávú facilitáció mértékében is.
A második cél, egy új immunlokalizációs módszer kifejlesztése volt, amely lehetővé teszi nagyszámú fehérje funkcionálisan jellemzett szinapszisokban történő lokalizációját. A laboratóriumunk megállapította, hogy az immunjel erőssége tovább növelhető ha 1%-os SDS oldattal 80 fokon egy óráig kezeljük a metszeteinket. A pályázat lezárását követően bebizonyítottuk, hogy a módszerünk alkalmas in vitro elvezetett és feltöltött sejtek azonosított szinapszisainak proteomikai analizálására in vitro két-foton mikroszkópos vizsgálatok után is. Az eredményeink jelenleg publikálásra előkészített állapotban vannak.
Results in English
This application was terminated after three month in 31st December 2017 upon the request of the applicant.
The major results are the following. To achieve the first specific aim, we have performed paired whole-cell recordings from synaptically connected hippocampal CA1 pyramidal cells and O-LM interneurons. Our results revealed large variability in the amplitude and degree of short-term facilitation of the unitary EPSCs.
To achieve our second specific aim, we developed an antigen retrieval method after etching 200 nm this ultra-thin sections with Na-ethanolate to further increase the sensitivity of the immunoreactions. This include the treatment of the sections with the solution of 1% SDS for 60 min at 80 degrees. This was followed by a number of technical development in the past year to verify the applicability of our post-embedding immunolocalization method for determining a large number of proteins in functionally characterized single synapses.
