In Vivo Studies supporting the Allele-Specific Conformational Therapy In Generalized Arterial Calcification of Infancy  Page description

Help  Print 
Back »
 

Details of project

  
Identifier
123859
Type PD
Principal investigator Tőkési, Natália
Title in Hungarian A csecsemőkori generalizált arteriás meszesedésben szenvedő betegek allél specifikus terápiáját előkészítő in vivo vizsgálatok.
Title in English In Vivo Studies supporting the Allele-Specific Conformational Therapy In Generalized Arterial Calcification of Infancy
Keywords in Hungarian ENPP1, GACI, 4- PBA
Keywords in English ENPP1, GACI, 4-PBA
Discipline
Molecular biology (Council of Medical and Biological Sciences)70 %
Ortelius classification: Molecular markers and recognition
Experimental pharmacology, drug discovery and design (Council of Medical and Biological Sciences)30 %
Panel Physiology, Pathophysiology, Pharmacology and Endocrinology
Department or equivalent Institute of Molecular Life Sciences (Research Center of Natural Sciences)
Participants Váradi, András
Starting date 2017-12-01
Closing date 2021-11-30
Funding (in million HUF) 15.216
FTE (full time equivalent) 3.20
state closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
Számos mechanizmus jár pirofoszfát (PPi) felszabadulással, ami az ektópikus meszesedés egyik inhibitora. Az ENPP1 (Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase Family Member 1) fehérjének jelentős szerepe van a PPi képzésében; az ATP-t AMP-vé és PPi-á hasítja a májsejtek felszínén. Az ENPP1 mutációi a keringésben lévő PPi koncentrációjának csökkenését eredményezik, ami az örökletes csecsemőkori generalizált artériás meszesedés (GACI) nevű betegségben ektópikus meszesedés kialakulásához vezet. Számos klinikailag releváns „missense” ENPP1 mutáció hibás fehérje feltekeredést, destabilizációt és lebomlást és/vagy helytelen szállítódást és így abnormális lokalizációt okoz. A hibás konformációjú/lokalizációjú mutánsok szerkezete kijavítható/„kisegíthetőek” a plazma membránba az FDA által elfogadott, 4-fenilbutirát (4-PBA) és analóg molekulája a Ravicti segítségével. A GACI betegek jelentős részénél „missense” mutáció található, így az ENPP1 farmakológiai „javítása” számottevő lehet. Célunk olyan ENPP1 „missense” mutánsok azonosítása, amelyek: 1) hibás feltekeredés miatt instabilak és lebomlanak és/vagy helytelen szállítódás miatt sejten belüli lokalizációt mutatnak; 2) 4-PBA/Ravicti alkalmazásával szerkezetük korrigálható és/vagy a plazma membránba irányíthatóak; 3) a kezelést követően visszanyerik a lágyszöveti meszesedést csökkentő tulajdonságukat. A vizsgálatok egy olyan, már korábban kidolgozott in vivo kísérleti rendszerben fogjuk végezni, amelyben jól vizsgálható, hogy a 4-PBA/Ravicti alkalmas-e a hibás szerkezetű/lokalizációjú ENPP1-t kijavítani/a plazma membránba irányítani és ezáltal potenciális terápiát tudunk javasolni a jelenleg még gyógyíthatatlan betegségre.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
A csecsemőkori generalizált artériás meszesedés (GACI) egy változatos megjelenésű meszesedéssel járó örökletes betegség. A tünetek a kötőszövetekben megjelenő kalcium lerakódások következményei. Kialakulásáért az ENPP1 (Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase Family Member 1) fehérje génjét érintő mutációk a felelősek. Az ENPP1 fehérje a meszesedést gátló pirofoszfát (PPi) képződésének egyik központi eleme; az ENPP1 hasítja az ATP-t PPi-vá és AMP-vé a májsejtek felszínén. Az ENPP1 mutációk egy része a fehérje hibás feltekeredéséhez (misfolding), destabilizációjához és lebomlásához és/vagy hibás szállítódása révén (mistrafficking) rossz lokalizációhoz pl: a sejten belül rekedéséhez vezet. Ezen mutációk esetében potenciális terápiás lehetőséget jelenthet az FDA (Amerikai Élelmiszer-, és Gyógyszer Ellenőrző Hatóság) által jóváhagyott kémiai dajka-molekulának, a 4-fenilbutirátnak (4-PBA) vagy analóg molekulájának a Ravictinek az alkalmazása. Publikált közlemények leírták, hogy progresszív familiar intrahepatic cholestasis type 2 (PFIC2) betegségben szenvedőkben a 4-PBA-val történő kezelés megnövelte a mutáns ABCB11 fehérjének a májsejtek sejtek kanikuláris membránjába történő lokalizációját, ami emelkedett májfunkció kialakulásához vezetett. Hasonló koncepció alapján szeretnénk alkalmazni a 4-PBA-t és a Ravicti-t olyan ENPP1 „missense” mutánsok esetében, melyek hibás szerkezete/lokalizációja kémiai dajka-molekulák segítségével kijavítható ezáltal potenciális célpontjai lehetnek a jelenleg még nem gyógyítható GACI allél specifikus konformációs terápiájának.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
A csecsemőkori generalizált artériás meszesedés (GACI) egy progresszív örökletes betegség, amit az ENPP1 (Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase Family Member 1) fehérje génjében kialakuló mutációk okoznak, és a kötőszövetekben történő kalcium lerakódások jellemzik. Az ismert, hogy a pirofoszfát (PPi) a kötőszöveti meszesedés inhibitora. A PPi keletkezését a hepatocitákból történő ATP felszabadulás befolyásolja, mely extracellulárisan az ENPP1 enzimatikus hasítása révén PPi-vé és AMP-vé alakul. A GACI betegekben alacsony a vér PPi koncentrációja, így a nem hidrolizálható PPi analógok közé tartozó biszfoszfonátok alkalmazása a betegség progressziójának megakadályozására kézenfekvő lenne. Hatásuk azonban a GACI betegségben nem tisztázott, hiszen esetleg a súlyos mellékhatások elnyomnák az ektópikus meszesedés gátlásának előnyeit. A közelmúltban megjelent három tanulmány, amely leírja, hogy progresszív familiar intrahepatic cholestasis type 2 (PFIC2) megbetegedésben szenvedő betegek májfunkciója megemelkedett az FDA (Amerikai Élelmiszer-, és Gyógyszer Ellenőrző Hatóság) által jóváhagyott kémiai dajka (chaperon) molekulaként működő 4-fenilbutirát (4-PBA) kezelést követően. A PFIC2 betegekben a transzporter fehérje (ABCB11) endoplazmatikus retikulumban való megrekedéséért „missense” mutációk a felelősek. A 4-PBA kezelés elősegítette az ABCB11 mutáns fehérjék kijutását a hepatociták kanikuláris membránjába, ami megnövekedett májfunkciót eredményezett. Hasonló elv valósítható meg GACI betegekben. Az ENPP1 mutáns fehérjék szerkezetének/lokalizációjának korrekciója egy kiváló lehetőség a betegség progressziójának megakadályozásában. Munkánk során olyan ENPP1 mutánsok vizsgálatával foglalkozunk majd, amelyek az kollaborációs partnerünk által létrehozott nemzetközi GACI adatbázisban szereplő betegekben előfordulnak. A kutatás alapjául szolgálhat majd olyan GACI betegek kiválasztásának, akik bevonhatóak a 4-PBA-nak vagy analóg molekulájának a Ravicti-nek a klinikai kipróbálásába.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
A puha szövetekben észlelet meszesedési folyamatok háttérében sokféle környezeti ártalom, komplex patológiás állapotok, a természetes öregedés és számos genetikai betegség állhat. A puha szövetek patológiás meszesedésének egyik genetikai modellje a csecsemőkori generalizált artériás meszesedés (GACI). A GACI igen progresszív betegség, amit a lágy kötőszövetekben történő kalcium lerakódások jellemeznek. A betegség lefolyása nem megjósolható és általában igen gyors. A betegség kialakulása az ENPP1 fehérje génjében kialakuló mutációk következménye, ami az ENPP1 fehérje hiányát vagy működészavarát okozza. A hibás ENPP1 fehérje nem képes adott molekulák elhasítására, így közvetett módon járul hozzá a pirofoszfát (PPi) felszabadulásának csökkenéséhez, ami a meszesedési folyamatokat gátolná. Ígéretes terápiának tűnik egy, az FDA (Amerikai Élelmiszer-, és Gyógyszer Ellenőrző Hatóság) által jóváhagyott 4-fenilbutirát (4-PBA) nevű molekula, amit már használnak más, örökletes anyagcsere-betegség kezelésére. Ha az ENPP1 fehérjét érintő mutáció hibás szerkezetű és/vagy lokalizációjú fehérjét eredményez, akkor a 4-PBA kezelés elősegíti a fehérje megfelelő szerkezetének kialakulását/fiziológiás helyére juttatását, így közvetett módon a meszesedést gátló PPi mennyiségének emelkedéséhez vezet. Munkánk során a mutáns emberi ENPP1 fehérje DNS-ét egerekbe bejuttatva vizsgálni tudjuk, hogy a 4-PBA kezelés elősegíti-e a mutáns ENPP1 fehérje megfelelő szerkezetének kialakulását/fiziológiás helyére történő irányítását és ezáltal meszesedés gátlását. Az egereken történő vizsgálataink alapjául szolgálhatnak a molekulák klinikai kipróbálásának GACI betegeknél.
Summary
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
Several mechanisms are involved in the generation of pyrophosphate (PPi), an inhibitor of ectopic calcification. ENPP1 (Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase Family Member 1) has a crucial role in this process, since it enzymatically converts ATP into AMP and PPi on the surface of hepatocytes. Mutations in Enpp1 result in low circulating levels of the calcification inhibitor PPi and consequently, the development of ectopic calcification in the hereditary disorder, Generalized Arterial Calcification of Infancy (GACI). Several clinically relevant missense ENPP1 mutations result in the misfolding, destabilization and degradation and/or mistrafficking and mislocalization of the protein in cell. This type of ENPP1 mutants can be refolded, stabilized and/or redirected to the plasma membrane by the FDA-approved drug, 4-phenylbutyrate (4-PBA) or its analog molecule Ravicti that act as chemical chaperones. As majority of the GACI patients have missense mutation, the therapeutic potential of the pharmacological correction of ENPP1 is considerable. Our aim is to identify those full-length ENPP1 missense mutants that 1) are missfolded, destabilized and degraded and/or misstrafficed and retained intracellularly; 2) can be refolded, stabilized and redirected to the plasma membrane using 4-PBA/Ravicti; 3) have regained their capacity to attenuate soft tissue calcification due to 4-PBA/Ravicti treatment. Experiments will be carried out with an in vivo assay that we have set up earlier and is suitable to determine which ENPP1 mutants are amendable for correction with 4-PBA/Ravicti thus we can suggest allele-specific conformational therapy for this currently incurable disease.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
Generalized Arterial Calcification of Infancy (GACI), a heritable ectopic mineralization disorder, represents phenotypically diverse conditions characterized by calcium depositions in connective tissues. A defect in the Enpp1 (Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase Family Member 1) gene is mainly responsible for GACI. ENPP1 has been identified as a crucial factor in the generation of the calcification inhibitor pyrophosphate (PPi), since ENPP1 convers ATP into PPi and AMP on the surface of hepatocytes. Several ENPP1 missense mutations result in the misfolding, destabilization and degradation and/or mistrafficking, mislocalization and retention of the protein in the cytoplasm. In case of such mutations a potential prospect could be the usage of the FDA-approved drugs, like 4-phenylbutyrate (4-PBA) or its analog molecule Ravicti that perform chemical chaperone activity. Published reports described, that 4-PBA treatment enhanced trafficking of ABCB11 mutants in patients suffering from progressive familiar intrahepatic cholestasis type 2 (PFIC2) to the canalicular membrane of the hepatocytes and improved liver function. Based on a similar concept we plan to apply 4-PBA and Ravicti, in case of those ENPP1 mutations which faulty protein conformation/localization can be corrected by chemical chaperones thus are potential targets of the allele specific therapy of the currently incurable disease: GACI.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
Generalized Arterial Calcification of Infancy (GACI) is a progressive inherited disorder caused by mutations in the Enpp1 (Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase Family Member 1) transporter gene and characterized by the accumulation of calcium deposition in connective tissues. It is known that pyrophasphate (PPi) can act as a potent inhibitor of connective tissue calcification. The source of systemic PPi is the ATP release from hepatocytes, since outside of the cells ATP is converted enzymatically to PPi and AMP by ENPP1. GACI patients suffer from highly reduced levels of PPi in their blood. Bisphosphonates, a class of non-hydrolysable PPi analogues seem to be an attractive approach to halt disease progression in GACI patients. Their efficacy in GACI is unclear as the disease needs life-long treatment and it is unclear whether the ectopic calcification inhibitory potency of bisphosphonates outweighs their occasionally serious side effects or not. On the other hand, three recent reports describe that the liver function of patients suffering from progressive familiar intrahepatic cholestasis type 2 (PFIC2) was improved by the FDA-approved (Food and Drug Administration) chemical chaperone; 4-phenylbutyrate (4-PBA) treatment. In all patients missense mutations resulted in retention of the transporter (ABCB11) in the endoplasmic reticulum. 4-PBA treatment enhanced trafficking of these ABCB11 mutants to the canalicular membrane of the hepatocytes and improved liver function. Similar strategy could be implemented in GACI patients. Correction of misfolded/mistrafficked ENPP1 mutants seems an attractive approach to halt disease progression in GACI patients. We will focus our efforts on the ENPP1 missense mutations found in patients registered in the international GACI registry created by or collaborator Prof. Frank Rutsch (Munster, Germany). My work might provide the basis of selection of GACI patients whom can be enrolled in a clinical trial.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
Arteriosclerosis (soft tissue calcification) is usually caused by diverse environmental risks (eg. smoking), complex pathological states (eg. chronic renal failure), naturally occurring aging and many genetical disorders. A very important pathological model of soft tissue calcification is generalized arterial calcification of infancy (GACI). GACI is a progressive disorder that is characterized by the accumulation of calcium depositions in soft connective tissues. The progression of GACI is relatively fast and unpredictable. GACI patients have mutations in the Enpp1 gene, which lead to an absent or nonfunctional ENPP1 protein. Mutated ENPP1 cannot take part in pyrophosphate (PPi) release, which can prevent the pathological depositions of calcium. There is no cure for GACI but a promising way of treatment might be the usage of a FDA-approved (Food and Drug Administration) molecule 4-phenylbutyrate (4-PBA), that is applied in the clinics to cure an urea cycle genetic disorder. If the mutation of Enpp1 changes the conformation/localization of the protein then 4-PBA can refold/redirect the mutant proteins to their appropriate place and indirectly increase the level of calcification inhibitor PPi in the blood. We have the animal model of GACI with similar symptoms as GACI patients. We can introduce the mutated form of the human ENPP1 protein into these mice and we can treat them with 4-PBA and examine the possible correction in the conformation/localization of the mutated ENPP1. Based on our results with mice, a human clinical trial on GACI patients might be started.




 

Final report

  
Results in Hungarian
Az elmúlt három évben sikeresen elvégeztem mindazokat a kísérleteket, melyeket a PD-OTKA keretében vállaltam. Az első évben az előzetes in vitro kísérletek alapján kiválasztottam hat ENPP1 mutánst az in vivo kísérletekhez és a vad típussal kiegészitve a listát klonoztam a megfelelő pLIVE vektorba. A project második évében megvizsgáltam a mutánsok sejten belüli lokalizációját egér májban. Kísérleteim azt mutatták, hogy mind a hat mutáns a májsejtek citoplazmában található, még az az egy is ami in vitro a plazma membránban lokalizálódott. Kimutattam, hogy korábbi várakozasaink ellenére a vad típusú ENPP1 exogén expressziója az ENPP1-/- egerek májában nem tudja annyira megemelni az endogen PPi szintet, ami elegendő lenne a lágyszöveti kalcifikáció megakadályozására. Végül pedig kiderült, hogy a 4-PBA kezelés nem képes a kiválasztott hat mutáns fehérje közül egyet sem a plazma membránba vinni. Ugyanezt az eredményt kaptam a projektem harmadik évében, egy másik kémiai chaperonnal, a Ravicivel. Mindemelett számos publikációm jelent meg ezen időszakban, melyben a PPi képes volt meggátolni a lágyszöveti meszesedést más betegség modellekben.
Results in English
In summary, I have managed to perform all the experiments that were planned in the three years of my post-doc grant. In the first year I had selected six ENPP1 mutants for the in vivo studies based on the previous in vitro experiments and I cloned them together with the human wtENPP1 into the pLIVE vector, having a liver specific promoter, essential for the in vivo studies. In the second year I determined the intracellular localization of the mutants within mouse hepatocytes. I found that all of them retained intracellularly, even the one that was localized within the plasma membrane in vitro. I also showed that the extensive expression of the wtENPP1 within the Enpp1-/- mouse did not rescued the calcification phenotype although it localized nicely at the plasma membrane of the liver cells suggesting that the exogenously expressed ENPP1, is not enough to restore the physiological level of PPi in the circulation that could prevent calcification. I also found that 4-PBA treatment was not able to redirect any of the six intracellularly retained mutants into the plasma membrane. I got similar results with the other potential chemical chaperon Ravicti in the third year of my PD-OTKA project. Ravicti was also unable to correct the miss-localization of the selected mutants. However, meanwhile I published several other papers in which PPi therapy was effective in other ectopic calcification diseases.
Full text https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=123859
Decision
Yes





 

List of publications

  
*Dedinszki D, *Szeri F, Kozak E, Pomozi V, Tokesi N, Mezei TR, Merczel K, Letavernier E, Tang E, Le Saux O, Aranyi T, van de Wetering K, Varadi A: Oral administration of pyrophosphate inhibits connective tissue calcification., EMBO MOL MED 9: (11) 1463-1470, 2017
Kozák E, Szikora B, Iliás A, Jani P K, Hegyi Z, Matula Zs, Dedinszki D, Tőkési N, Fülöp K, Pomozi V, Várady Gy, Bakos É, Tusnády G E, Kacskovics I, Váradi A: Creation of the first monoclonal antibody recognizing an extracellular epitope of hABCC6., FEBS LETTERS 595: (6) pp. 789-798., 2021
Kozák Eszter, Fülöp Krisztina, Tőkési Natália, Rao Nidhi, Li Qiaoli, Terry Sharon F., Uitto Jouni, Zhang Xiaoming, Becker Cyrus, Váradi András, Pomozi Viola: Oral supplementation of inorganic pyrophosphate in pseudoxanthoma elasticum, EXPERIMENTAL DERMATOLOGY, 2021
*Dedinszki D, *Szeri F, Kozak E, Pomozi V, Tokesi N, Mezei TR, Merczel K, Letavernier E, Tang E, Le Saux O, Aranyi T, van de Wetering K, Varadi A: Oral administration of pyrophosphate inhibits connective tissue calcification., EMBO MOL MED 9: (11) 1463-1470, 2017
Kozák E, Szikora B, Iliás A, Jani P K, Hegyi Z, Matula Zs, Dedinszki D, Tőkési N, Fülöp K, Pomozi V, Várady Gy, Bakos É, Tusnády G E, Kacskovics I, Váradi A: Creation of the first monoclonal antibody recognizing an extracellular epitope of hABCC6., FEBS LETTERS, 2020
Tőkési N., Kozák E., Fülöp K., Dedinszki D., Hegedűs N., Király B., Szigeti K., Ajtay K., Jakus Z., Zaworski J., Letavernier E., Pomozi V., Váradi A.: Pyrophosphate therapy prevents trauma-induced calcification in the mouse model of neurogenic heterotopic ossification, JOURNAL OF CELLULAR AND MOLECULAR MEDICINE 24: (20) pp. 11791-11799., 2020
Pomozi V, Julian CB, Zoll J, Pham K, Kuo S, Tőkési N, Martin L, Váradi A, Le Saux O.: Dietary Pyrophosphate Modulates Calcification in a Mouse Model of Pseudoxanthoma Elasticum: Implication for Treatment of Patients., PMID: 30468740, 2019
Väärämäk Suvi, Uusitalo Hannu, Tőkési Natália, Pelttari Saku, Váradi András, Nevalainen Pasi I: Pyrophosphate Treatment in Pseudoxanthoma Elasticum (PXE)-Preventing ReOcclusion After Surgery for Critical Limb Ischaemia, SURGICAL CASE REPORTS 2198-7793: pp. 1-3., 2019
Pomozi V, Julian CB, Zoll J, Pham K, Kuo S, Tőkési N, Martin L, Váradi A, Le Saux O.: Dietary Pyrophosphate Modulates Calcification in a Mouse Model of Pseudoxanthoma Elasticum: Implication for Treatment of Patients., PMID: 30468740, 2018
*Dedinszki D, *Szeri F, Kozak E, Pomozi V, Tokesi N, Mezei TR, Merczel K, Letavernier E, Tang E, Le Saux O, Aranyi T, van de Wetering K, Varadi A: Oral administration of pyrophosphate inhibits connective tissue calcification., EMBO MOL MED 9: (11) 1463-1470, 2017



Back »