 |
POTENTIAL ROLE OF TPPP/p25 IN THE ULTRASTRUCTURAL ORGANIZATION OF THE MULTIFUCTIONAL MICROTUBULAR NETWORK
|
Help 
Print 
|
Here you can view and search the projects funded by NKFI since 2004
Back »
|
| |
Details of project |
|
|
| Identifier |
124061 |
| Type |
PD |
| Principal investigator |
Szénási, Tibor |
| Title in Hungarian |
A TPPP/p25 lehetséges szerepe a multifunkcionális mikrotubuláris hálózat ultrastruktúrájának szabályozásában |
| Title in English |
POTENTIAL ROLE OF TPPP/p25 IN THE ULTRASTRUCTURAL ORGANIZATION OF THE MULTIFUCTIONAL MICROTUBULAR NETWORK |
| Keywords in Hungarian |
TPPP/p25, mikrotubulus, TAU, tubulin deacetiláz, BIFC |
| Keywords in English |
TPPP/p25, microtubule, TAU, tubulin deacetylase, BIFC |
| Discipline |
| Molecular biology (Council of Medical and Biological Sciences) | 70 % | | Ortelius classification: Molecular biology | | General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences) | 30 % | | Ortelius classification: Biochemistry |
|
| Panel |
Molecular and Structural Biology and Biochemistry |
| Department or equivalent |
Institute of Molecular Life Sciences (Research Center of Natural Sciences) |
| Starting date |
2017-09-01 |
| Closing date |
2021-02-28 |
| Funding (in million HUF) |
15.216 |
| FTE (full time equivalent) |
2.45 |
| state |
closed project |
Summary in Hungarian A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
A változatos funkciójú citoszkeletális mikrotubulus (MT) hálózat stabilitása és dinamikája poszt-transzlációs módosítások és a hozzá kapcsolódó citoszolikus fehérjék/enzimek szabályozzák. Ebben a pályázatban célul tűztem ki, hogy jellemzem a MT hálózat sokrétű asszociációját a Tubulin Polimerizációt Promótáló Proteinnel (TPPP/p25) és a tubulin deacetilázokkal (HDAC6 és SIRT2), amelyek a MT rendszer dinamikáját és stabilitását befolyásolják. A TPPP/p25 páronkénti kölcsönhatásait a tubulin deacetilázokkal, mely megnövekedett acetil-tubulin szintet eredményez, már leírták; azonban a MT hálózathoz kötődő ezen multiprotein komplexek szerkezeti és funkcionális jellemzőit még nem vizsgálták sem izolált fehérjékkel, sem élő sejtekben. A TAU egy kulcs MAP fehérje, melynek a TPPP/p25 által szabályozott multifunkciónális folyamatokban betöltött szerepét szintén jellemezni fogom. A tubulin deacetilázok potenciális rákellenes gyógyszercélpontok, melyek aktivitását a TPPP/p25 vagy kiválasztott fragmensei gátolhatják, ami a MT hálózat acetiláció szintjét szelektíven növelve ellensúlyozhatja a kontroll nélküli mitózist. A hetero-asszociációkat különböző spektroszkópiai, ELISA és kromatógráfiás módszerrel jellemzem. BiFC technológia használatával és kiterjesztésével (többszínű BiFC és FRET-BiFC) a laboratóriumunkban lehetővé válik a multiprotein komplexek kimutatása, ko-lokalizációjuk vizsgálata a MT hálózattal, továbbá a tubulin-HDAC6/SIRT2 kötőfelszínének, mint rákellenes gyógyszercélpontnak, a validálása élő sejtben. A projekt sikeres teljesítése hozzájárul a MT hálózat által szabályozott fiziológiás és patológiás folyamatok megértéséhez.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
A project céljai jellemezni a TPPP/p25, a TAU és a tubulin deacetiláz HDAC6 és SIRT2 kapcsolatát a mikrotubuláris (MT) rendszer acetilációs szint által befolyásolt dinamikájára és ultrastruktúrájára. A rendezetlen TPPP/p25, mint MAP fehérje, a MT rendszer dinamikáját és stabilitását szabályozza, mikrotubulus kötegelő és acetilációt fokozó aktivitásai révén. A TAU egy kulcs MAP fehérje, amely szintén elősegíti a mikrotubulusok polimerizációját és stabilizálja őket, a HDAC6 aktivitását gátolja. Ezért i) jellemezni fogom a TPPP/p25 hatását a HDAC6 és/vagy SIRT2 tubulin/MT-hoz való asszociációjára alacsony és magas acetilációs szint esetén, ii) tanulmányozom a TAU és TPPP/p25 együttes hatását az acetilációtól függő MT hálózathoz való asszociációikra iii) azonosítom a HDAC6-tubulin komplex kialakításában részt vevő kötő szegmenseket, és a TAU és/vagy TPPP/p25 hatását. Ezeket a vizsgálatokat molekuláris és sejt szinten fogom végezni. A hetero-asszociációkat CD és fluoreszcens spektroszkópiával, ELISA-val, méretkizárásos és affinitás kromatográfiával jellemzem és kvantifikálom. A MT-hoz kapcsolódó fehérjék multikomplexének jellemzésére többszínű és FRET-BiFC technikát vezetek be, melyekkel vizsgálhatók a MT hálózathoz asszociált kettős ás hármas komplex (TPPP/p25-HDAC6-SIRT2) különböző acetilációs szinteknél. Vad típusú és mutáns fehérjék (HDAC6, tubulin, TPPP/p25) különböző konstrukciót alkalmazva azonosítom a többféle kölcsönhatásban részvevő szegmenseket/struktúrákat, ami hozzájárulhat egyedi specificitású gyógyszermolekulák kifejlesztéséhez.
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
A citoszkeleton az eukarióta élőlények minden sejtjében jelen van; egymással összekapcsolt filamentumok és tubulusok komplex rendszere, mely a teljes citoplazmát behálózza. A citoszkeletális mátrix, ami magában foglalja a mikrotubuláris hálózatot is, egy igen dinamikus struktúra, ami a sejt követelményeitől függően képes gyors növekedésre vagy szétesésre. A sokrétű funkcióval rendelkező citoszkeletális mikrotubulus hálózat stabilitását és dinamikáját poszt-transzlációs módosítások és citoszolikus fehérjékkel/enzimekkel való dekorációja szabályozza, ezen folyamatok kontrollálása kulcskérdés fiziológiás funkcióinak, mint az intracelluláris transzport, sejtosztódás és a differenciáció, ellátásához; a mikrotubuláris hálózat csökkent vagy túlzott stabilizációja szoros kapcsolatban áll a rák kialakulásával, amit a rák ellenes molekulák sikeres alkalmazása is mutat, például a taxolé (stabilizál) és a Vinca alkaloidoké (destabilizálnak). Ebben a pályázatban célul tűztem ki, hogy jellemzem és szelektíven befolyásolom a mikrotubuláris rendszer dinamikáját acetilációs szintjének módosításával, deacetiláz inhibitorok és a rákellenes aktivitással bíró Tubulin Polimerizációt Promótáló Protein (TPPP/p25) expressziója révén. Vizsgálataimhoz human rekombináns fehérjéket használok in vitro (ELISA, fluoreszcens spektroszkópia, kromatográfiás módszerek), míg a mikrotubulushoz kötődő fehérjék hetero-asszociációját immunflureszcens mikroszkópiás BIFC technológiával tanulmányozom fúziós variánsaik segítségével. A többszínű BiFC és FRET-BiFC technológiák bevezetése lehetőséget biztosít a multiprotein komplexek jellemzésére. A projekt egyik fő célja a tubulin-deacetiláz komplex kötőfelszínének azonosítása és validálása, ami alapvető kritérium nagy specificitású, minimális mellékhatással rendelkező rákellenes gyógyszermolekulák kifejlesztéséhez. A projekt sikeres teljesítése hozzájárul a mikrotubuláris hálózat által szabályozott fiziológiás és patológiás folyamatok megértéséhez.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
A változatos funkciójú mikrotubulus (MT) hálózat, mely a sejtváz fontos eleme, stabilitását és dinamikáját enzimatikus módosítások és a hozzá kötődő különböző fehérjék szabályozzák. Ebben a pályázatban célul tűztem ki, hogy jellemzem a MT hálózat sokrétű asszociációját a Tubulin Polimerizációt Promótáló Proteinnel (TPPP/p25) és a tubulin deacetiláz enzimekkel, amelyek a MT rendszer dinamikáját és stabilitását befolyásolják. A TPPP/p25 páronkénti kölcsönhatásait a tubulin deacetilázokkal, mely növeli az acetil-tubulin szintet, már leírták; azonban a MT hálózathoz kötődő ezen multiprotein komplexek szerkezeti és funkcionális jellemzőit még nem vizsgálták sem izolált fehérjékkel, sem élő sejtekben. A TAU szerepét, ami egy kulcsfehérje az MT stabilizációjában, szintén jellemezni fogom, hogy megvizsgáljam a TAU és a TPPP/p25 együttes hatását a MT hálózat stabilitására és acetilációs szintjére. A tubulin deacetilázok potenciális rákellenes gyógyszercélpontok. A TPPP/p25 gátolja a deacetilázok aktivitását, és rákellenes aktivitás mutat, így a kötődésben részt vevő fragmensei specifikusan növelhetik a MT acetilációt, ami ellensúlyozhatja a kontroll nélküli sejtosztódást. A páronkénti kölcsönhatásokat különböző molekuláris és fluoreszcencia alapú sejtes módszerrel fogom jellemezni, a sejtes módszer kiterjesztése segít egyidejűleg tanulmányozni a többszörös kölcsönhatásokat. A MT és tubulin deacetilázok kölcsönhatásában szerepet játszó kötőszegmenseket azonosítom és rákellenenes gyógyszercélpontként validálom. A projekt sikeres teljesítése hozzájárul a különböző enzimek/fehérjék által szabályozott MT hálózat fiziológiás és patológiás folyamatokban való szerepének megértéséhez.
| Summary Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
The stability and dynamics of the multifarious cytoskeletal microtubule (MT) network are regulated by post-translational modifications and by its decoration with cytosolic proteins/enzymes. The objective of this proposal is the characterization of the multiple associations of the MT network with Tubulin Polymerization Promoting Protein (TPPP/p25) as well as tubulin deacetylases (HDAC6 and SIRT2) that modulate the dynamics and stability of the MT system. The pair-wise interactions of TPPP/p25 with tubulin deacetylases resulting in elevated acetylation level have been reported; however, the structural and functional aspects of the multiprotein complexes of MTs have been established neither with isolated proteins nor in living cells. The role of the TAU, a key MAP protein, will also be characterized in relation of the TPPP/p25-derived multifunctional processes. Tubulin deacetylases are potential anti-cancer drug targets, their inhibition by TPPP/p25 or its selected fragments could selectively enhance the acetylation level of the MT network counteracting the uncontrolled mitosis. The hetero-associations will be characterized by different spectroscopic, ELISA and chromatographic methods. The installation and extension of BiFC technology (multicolor BiFC and FRET-BiFC) in our lab will render it possible the visualization of multiprotein complexes, their co-localizations with the MT network and validation of the interfaces of tubulin-HDAC6/SIRT2 as an anti-cancer drug target in living cells. The successful fulfilment of the project will contribute to the understanding of the MT network-derived physiological and pathological processes.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
The project aims to characterize the relationship of TPPP/p25, TAU and the tubulin deacetylase HDAC6 and SIRT2 with regard to the acetylation level-derived ultrastructure and dynamics of the microtubule (MT) system. The disordered TPPP/p25 modulates the dynamics and stability of the MT system as a MAP protein by its MT bundling and acetylation enhancing activities. TAU, a key MAP, also promotes the assembly and stabilization of MTs and inhibits HDAC6 activity. Therefore, I will i) characterize the effect of TPPP/p25 on the associations of HDAC6 and/or SIRT2 to tubulin/MTs at low and high acetylation levels; ii) study the mutual effects of TAU and TPPP/p25 on their acetylation-dependent associations to the MT network, iii) identification of binding segments involved in HDAC6-tubulin complex; influence of TAU and/or TPPP/p25. These studies will be performed at molecular and cellular levels. The hetero-associations will be characterized and quantified by means of CD and fluorescence spectroscopy, ELISA and size exclusion and affinity chromatography. For the characterization of the multicomplexes of MT-related proteins, the multi-color BiFC and FRET-BiFC technology will be introduced to visualize binary and ternary complexes (TPPP/p25-HDAC6-SIRT2) associated on the MT network at distinct acetylation levels. Different constructs of the wild type and mutant proteins (HDAC6, tubulin, TPPP/p25) will be applied to identify the segments/structures involved in the multiple interactions, which may contribute to the development of drugs with unique specificity.
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
Cytoskeleton is present in all cells of eukaryotes; it is a complex network of interlinking filaments and tubules extending throughout the cytoplasm. The cytoskeletal matrix including the microtubule network is a highly dynamic structure which is capable of rapid growth or disassembly dependening on the cell's requirements. The control of the stability and dynamics of the multifarious cytoskeletal microtubule network regulated by post-translational modifications and by its decoration with cytosolic proteins/enzymes is a key issue to fulfil its physiological functions such as intracellular transport, cell division and differentiation; the destabilization or over-stabilization of this network is closely related to cancer as demonstrated by the effective applications of anti-cancer drugs such as paclitaxel (stabilizers) and Vinca alkaloid (destabilizers). The objective of this proposal is the characterization and selective affecting of the dynamics of the microtubule system by controlling the acetylation levels by deacetylase inhibitors as well as by the expression of Tubulin Polymerization Promoting Protein (TPPP/p25) with its anticancer activity. My studies will be carried out with human recombinant proteins (in vitro studies such as ELISA, fluorescence spectroscopy, chromatography methods) and the fusion variants of these proteins will be used for visualization of the heteroassociations of the MT-related proteins by immunofluorescent confocal microscopy applying BiFC technology. The introduction of the multi-color BiFC and FRET-BiFC technology provides opportunity to characterize multiprotein complexes. One of the main aims of this project is the identification and validation of the interface of the tubulin-deacetylase complex that is a basic criterion for development anticancer drugs of unique specificity with minimal side effect. The successful fulfilment of the project will contribute to the understanding of the microtubule network-derived physiological and pathological processes.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
The stability and dynamics of the multifarious microtubule (MT) network, a constituent of cytoskeleton, are regulated by enzymatic modifications and by its decoration with various proteins. The objective of this proposal is the characterization of the multiple associations of the MT network with Tubulin Polymerization Promoting Protein (TPPP/p25) as well as tubulin deacetylase enzymes that modulates its dynamics and stability. The pair-wise interactions with tubulin deacetylases resulting in elevated acetylation level have been reported; however, the structural and functional aspects of the multiprotein complexes of MTs have been established neither with isolated proteins nor in living cells. The role of the TAU, a key protein in the stabilization of MTs, will be also characterized to evaluate the nature of their mutual effects on the acetylation and stability of the MT network. Tubulin deacetylases are potential anti-cancer drug targets. TPPP/p25 also behaves a deacetylase inhibitor and displays anti-cancer activity, thus one of its fragments involved in binding could specifically enhance MT acetylation counteracting the uncontrolled cell division. The pair-wise interactions will be characterized by various molecular and fluorescence-based cellular studies, the extension of the cellular method will help to visualize multiple interactions simultaneously. The binding segments involved in the interaction of MT and tubulin deacetylases will be identified and validated as an anti-cancer drug target. The successful fulfilment of the project will contribute to understand the role of enzyme/protein regulated MT network in physiological and pathological processes.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
