Quantitative reconstruction of dNTP homeostatic networks: application development for anticancer and antimicrobial discovery  Page description

Help  Print 
Back »

 

Details of project

 
Identifier
124527
Type FK
Principal investigator Tóth, Judit
Title in Hungarian dNTP homeosztatikus hálózatok kvantitatív rekonstrukciója: rákellenes és antimikrobiális kutatást támogató alkalmazás fejlesztése
Title in English Quantitative reconstruction of dNTP homeostatic networks: application development for anticancer and antimicrobial discovery
Keywords in Hungarian mutagenezis, nukleotid anyagcsere, kinetikai modell, validálás, web szerver, citosztatikum
Keywords in English mutagenesis, nucleotide metabolism, kinetic model, validation, web server, cytostatics
Discipline
Analysis, modelling and simulation of biological systems (Council of Medical and Biological Sciences)50 %
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)40 %
Ortelius classification: Metabolism
Bioinformatics (Council of Medical and Biological Sciences)10 %
Panel Genetics, Genomics, Bioinformatics and Systems Biology
Department or equivalent Institute of Molecular Life Sciences (Research Center of Natural Sciences)
Participants Füzesi, Dóra
Hirmondó, Rita
Molnár, Dániel
Surányi, Éva Viola
Szabó, Judit Eszter
Tankó, Éva
Trombitás, Tamás
Starting date 2017-12-01
Closing date 2022-05-31
Funding (in million HUF) 39.944
FTE (full time equivalent) 15.81
state closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

A tervezett munka során egy olyan, könnyen használható interaktív alkalmazást fejlesztünk, amely a dezoxinukleotid (dNTP) anyagcsere-hálózatok dinamikájának pontos reprodukciójára képes. Az eszköz alkalmas lesz hatóanyagok és/vagy mutációk intracelluláris dNTP-készletekre gyakorolt hatásának precíz meghatározására, hatékonyan elősegítve mind az alapkutatást, mind pedig a gyógyszerfejlesztést. A szolgáltatás egyik fő felhasználási területe a rákkutatás. A rosszindulatú átalakulások fő okát, a mutációk felhalmozódását a dNTP-készletek eltolódása illetve növekedése egyaránt nagymértékben felgyorsítja. A jóváhagyott rákgyógyszerek jelentős része a nukleotid-anyagcsere enzimein ható antimetabolit. A humán dNTP anyagcsere-dinamika pontos predikciójára képes alkalmazás ezért nagy előnyt jelenthet a rákellenes gyógyszerfejlesztésben. A rákképződésben betöltött szerepe mellett a dNTP-dinamika a bakteriális növekedés és gyógyszer-rezisztencia kialakulásában is központi jelentőséggel bír, előrevetítve a tervezett alkalmazás hasznát az antibakteriális szerek kutatás-fejlesztésében is. Tervezett munkánk célja (1) az ember illetve két baktériumfaj dNTP homeosztatikus hálózatának kinetikai rekonstrukciója, (2) a sejtbeli enzim- és dNTP-koncentrációk (mint bemeneti paraméterek) precíz kísérletes meghatározása, valamint (3) a modellek kísérletes validációja. A létrehozandó dNTPQuRe alkalmazás grafikusan reprezentált hálózatban teszi megfigyelhetővé a dNTP-készleteknek a perturbációk hatására bekövetkező változásait. A rendszer dinamikusan változó támadható pontjainak, “üvegnyak”-enzimeinek azonosítása különösen hasznos lehet a gyógyszer-érzékenyítés új módjainak felderítésében.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

A meglévő anyagcsere-predikciós eszközök modellegyenleteket kérnek bemenetként, amihez a felhasználó jelentős háttértudása szükséges. E feltétel jelentősen korlátozza a szolgáltatások molekuláris biológiai felfedező kutatásokban való hasznosíthatóságát. E korlátot egy könnyen használható webes alkalmazás létrehozásával kívánjuk feloldani, amely a dezoxinukleotid (dNTP) anyagcsere-hálózatok dinamikájának pontos reprodukciójára képes. Az eszköz hatékonyan alkalmazható lesz hatóanyagok és genetikai változások intracelluláris dNTP-készletekre gyakorolt hatásának pontos predikciójára. A szolgáltatás két hasznosítási kulcsterülete a rákkutatás és az antibiotikum-fejlesztés. Ezért a humán dNTP anyagcsere-hálózat mellet két baktériumfaj, a Mycobacterium tuberculosis és az Escherichia coli ilyen hálózati modelljét is létrehozzuk. A három szervezet egyúttal a dTTP-bioszintézis különböző természetes stratégiáit is képviseli. Alkalmazásunk elősegíti a hipotézisalkotást, a kísérlettervezést és a hatóanyag-fejlesztést, a következő kérdések megválaszolásával: Hogyan változtatja meg egy adott hatóanyag és/vagy mutáció a dNTP-készleteket a nevezett szervezetekben? Az adott hatóanyag vagy mutáció eltolódást, növekedést vagy csökkenést okoz a dNTP-készletekben? (E változások bármelyike lényegesen befolyásolhatja a mutációk keletkezését, a karcinogenezist, a gyógyszer-rezisztenciát és/vagy -érzékenységet.) Mik a gyógyászatban kihasználható különbségek a humán sejtek és a patogén baktériumok anyagcsere-dinamikája között? Melyek az érzékenységi forró pontok (“üvegnyak”-enzimek) a rendszerben, és ezek hogyan változnak meg a hatóanyagok vagy mutációk hatására?

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

Pályázatunk célja egy olyan könnyen használható interaktív alkalmazás létrehozása, amely képes a dezoxinukleotid (dNTP) anyagcsere-hálózatok dinamikájának pontos reprodukciójára. Ez az eszköz hatékonyan alkalmazható lesz hatóanyagok és/vagy genetikai változások (mutációk) intracelluláris dNTP-készletekre gyakorolt hatásának lehetőségek szerinti legpontosabb predikciójára, így elősegítve mind az alapkutatást, mind a gyógyszerfejlesztést. A jelenleg rendelkezésre álló útvonal- predikciós eszközök a felhasználó jelentős háttértudását igénylik, ami súlyosan korlátozza ezen alkalmazások használatát a molekuláris biológiai felfedező kutatásokban. Fejlesztendő alkalmazásunk egyedi sajátsága, hogy jelentős szakmai előfeltételek nélkül is használható lesz. Interaktív alkalmazásunk egyik fő felhasználási területe a rákkutatás. A rákos elváltozások nagy része spontán vagy indukált mutációk akkumulációjával jön létre. A spontán mutációk a rákos szövetekben legalább 200-szor gyakrabban fordulnak elő, mint az egészséges kiindulási szövetben. A mutagenezist a dNTP-készletek eltolódása illetve kiegyenlített akkumulációja egyaránt felgyorsítja. A jóváhagyott rákellenes szerek jelentős része a nukleotid-anyagcsere enzimein ható antimetabolit (DNS-prekurzor- vagy folsav-analóg; pl. gemcitabin, 5-fluorouracil, metotrexát). A humán dNTP anyagcsere-hálózatok dinamikáját pontosan prediktálni képes alkalmazás tehát jelentősen elősegítheti a rákellenes gyógyszerek fejlesztését. A rákban betöltött jelentősége mellett a dNTP-dinamika a bakteriális növekedés és gyógyszer-rezisztencia központi tényezője is. Ezért alkalmazásunkat kiterjesztjük a Mycobacterium tuberculosis és Escherichia coli baktériumok dNTP anyagcsere-hálózataira is, ami a bakteriális és humán dNTP anyagcsere-dinamika közötti, gyógyászatban kihasználható különbségek felderítése révén fogja elősegíteni az antibakteriális szerek tervezését.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.

Pályázatunk célja egy olyan interaktív internetes alkalmazás fejlesztése, amely képes pontosan jelezni a hatóanyagoknak és/vagy genetikai változásoknak (mutációknak) a DNS-építőkövek (dNTP-molekulák) sejtbeli készleteire gyakorolt hatását. Fejlesztendő alkalmazásunk egyedi sajátsága, hogy a felhasználótól nem kívánja meg az anyagcsere-hálózatok részletes előzetes ismeretét. Szabadon hozzáférhető alkalmazásunk fő felhasználási területei a rákkutatás és az antibiotikum-fejlesztés. A rák jelentős részben mutációk felhalmozódása révén jön létre. A mutációk a rákos szövetekben legalább 200-szor gyakrabban képződnek, mint az egészséges szövetekben. A sejtbeli dNTP-készletek megváltozása nagyban felgyorsítja a mutációk képződését. A dNTP-készleteket szabályozó enzimek számos rákellenes gyógyszer (pl. gemcitabin, 5-fluorouracil, methotrexát) célpontjai, mivel kulcsfontosságúak a sejtosztódásban és a sejtek túlélésében. A humán dNTP-anyagcsere dinamikáját pontosan előjelezni képes alkalmazásunk tehát nagyban elősegítheti a rákellenes gyógyszerek fejlesztését. A dNTP-készletek precíz fenntartása a baktériumok növekedésében is központi fontosságú, ezért a mikroorganizmusok anyagcseréjére is kiterjesztett alkalmazásunk jelentősen elősegítheti a baktériumok gyógyszer-rezisztenciájának megelőzését és antibiotikumok fejlesztését is. A humán dNTP-anyagcsere modellje mellett ezért megalkotjuk a tuberkulózis kórokozójának (Mycobacterium tuberculosis), illetve a biológiai kísérletekben leggyakrabban használt baktériumnak (Escherichia coli) a modelljét is.
Summary
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

In the proposed work we will develop an easily accessible interactive application that faithfully reproduces the dynamics of deoxynucleotide (dNTP) metabolic networks. This tool will be used for precise prediction of the effect of drugs and/or genetic variations/mutations on intracellular dNTP pools, thereby aiding both basic discovery and drug development. A key field benefitting from this service is cancer research. Mutagenesis, a root cause of malignancies, is greatly stimulated by either imbalance or expansion of dNTP pools. Many approved anticancer drugs are antimetabolites, which act on enzymes of nucleotide metabolism. An application with a high predictive power in human dNTP metabolic dynamics can therefore be of substantial value in future anticancer drug development. Besides its importance in cancer, dNTP dynamics is a central aspect affecting bacterial growth and drug resistance, highlighting the utility of our planned application in antimicrobial research and development, too. In the planned work we aim at the i) kinetic reconstruction of human and two different microbial dNTP homeostatic networks, ii) accurate determination of cellular enzyme and dNTP concentrations as input parameters, and iii) experimental validation of the models. The resulting application, dNTPQuRe, will allow the user to change enzyme activity and metabolite concentration parameters within the graphically represented network and observe changes in the dNTP pool upon perturbation. The quantitative determination of bottleneck enzymes, changing dynamically in response to parameter changes, will be particularly useful in exploring new ways for drug sensitization.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

The use of existing online biochemical pathway and flux prediction tools requires a series of model equations as input, which implies substantial prior knowledge in metabolic enzyme kinetics by the end user. This prerequisite seriously limits the utility of these services in routine practical molecular biology. We wish to overcome this limitation by developing an easily accessible interactive web application that faithfully reproduces the dynamics of deoxynucleotide (dNTP) metabolic networks. This tool will be readily applicable for the prediction of the effect of drugs or genetic variations on intracellular dNTP pools with the highest attainable precision. The key fields benefitting from this service are cancer research and antibiotic development. Therefore, we will reconstruct the human homeostatic dNTP network and those of two microbes, Mycobacterium tuberculosis and Escherichia coli, also representing three different strategies for dTTP biosynthesis. The planned application will be suitable for hypothesis generation, experiment design and drug development, in relation to the following questions: How does a particular drug and/or mutation change the dNTP pools in either of the named organisms? Does this specific condition cause an imbalance, expansion and/or depletion of dNTP pools? (Any of these changes can severely affect mutation formation/carcinogenesis, drug resistance and/or sensitivity.) What are the biomedically exploitable dNTP metabolic differences between human cells and pathogenic bacteria? Where are the hotspots of sensitivity (“bottleneck” enzymes) within the system, and how do these change upon drug treatment/mutations?

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

The focus of this proposal is the development of an easily accessible interactive application that faithfully reproduces the dynamics of deoxynucleotide (dNTP) metabolic networks. This tool will be readily applicable for the prediction of the effect of drugs and/or genetic variations/mutations on intracellular dNTP pools with the highest attainable precision, thereby aiding both basic discovery and drug development. There exist several online pathway prediction tools. However, the use of these program packages requires substantial prior knowledge by the end user, seriously limiting the utility of existing services in routine molecular biological discovery. Our application will be unique in that it can be used without any prerequisites. A key field benefitting from our freely accessible interactive service is cancer research. Cancer results in large part from the accumulation of spontaneous or induced mutations, spontaneous mutations being 200-fold more frequent than in normal tissues. Mutagenesis is greatly stimulated either by unbalanced dNTP pools or, intriguingly, also by balanced accumulation of all four dNTPs. Many approved anticancer drugs are antimetabolites, analogs of DNA precursors or those of folate, which act on enzymes of nucleotide metabolism (e.g. gemcitabine, 5-fluorouracil, and methotrexate). An application with a high predictive power in human dNTP metabolic dynamics can therefore be of substantial value in future anticancer drug development. Besides its importance in cancer, dNTP dynamics is a central aspect of bacterial growth and drug resistance. Therefore, we aim to develop the Mycobacterium tuberculosis and the Escherichia coli dNTP network applications as well, which will aid antibiotic drug design by revealing exploitable differences between human and bacterial dNTP metabolism.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.

The focus of this proposal is the development of an interactive web application for the prediction of the effect of drugs and/or mutations (genetic changes) on the intracellular pools of DNA building blocks called dNTPs. Our application will be unique in that it can be used without any prior knowledge by the end user in metabolic network reconstructions. The key fields benefitting from our freely accessible interactive service are cancer research and antibiotic development. Cancer results in large part from the accumulation of mutations. Spontaneous mutations are 200-fold more frequent in cancer tissues than in normal ones. The formation of mutations is greatly stimulated by the perturbation of the cellular dNTP pools. The enzymes that regulate dNTP pools are essential for cell division and viability and are the targets of many approved anticancer drugs (e.g. gemcitabine, 5-fluorouracil, and methotrexate). An application with a high predictive power in human dNTP metabolic dynamics can therefore be of substantial value in future anticancer drug development. The maintenance of healthy dNTP pools is also a central aspect of bacterial growth and, thus, applications tailored to microbes will be useful in understanding bacterial drug resistance and will aid antibiotic development. Therefore, besides modeling human dNTP metabolism, we will develop models for Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis, and for Escherichia coli, the most widely studied model bacterium.





 

Final report

 
Results in Hungarian
A DNS építőkövei, a dNTP-k készletének finomhangolt koncentrációja szükséges a normál sejtciklus és a genom integritásának fenntartásához. Ennek megfelelően a dNTP-készlet homeosztázisának szerepét demonstrálták a rák kialakulásában, az öregedésben és a vírusfertőzésekben is. Kísérleti és bioinformatikai eszközöket fejlesztettünk ki, hogy jobban megértsük a dNTP homeosztázis komplex biokémiai rendszerét. Továbbfejlesztettük egy dNTP mérési módszert, és hozzá egy automatizált kinetikai elemző szoftvert, amely széles körben elérhetővé teszi ezt az egyébként bonyolult esszét. Létrehoztunk egy dNTP adatbázist, amely rendszerezi az irodalmoban fellelhető mért dNTP-koncentrációkat. Páronkénti összehasonlítást tesz lehetővé bármely kiválasztott adatpár között, amely lehetővé teszi a dNTP-szint változásainak értelmezését stressz, kezelések vagy megváltozott genetikai háttér hatására. Kísérletileg meghatározott paraméterek alapján elkészítettük a dNTP homeosztázis kinetikai modelljét, amely ésszerű közelítési szintig reprodukálja a rendszer viselkedését. Kimutattuk, hogy az egymástól függetlenül működő dNTP metabolikus enzimek nem termelnek elég hatékonyan dNTP-t a normál sejtosztódáshoz. A dNTP termelés csak akkor elég gyors, ha az összes főbb dNTP szintézis enzim között kinetikai kapcsolás valósul meg, és ha a DNS replikációs központokat egy lokális dNTP-készlet táplálja, amely gyorsan feltöltődik a citoplazma dNTP-készletével való egyensúlyba kerülés nélkül.
Results in English
A fine-tuned concentration balance in the pool of dNTPs, the building blocks of DNA, is necessary to maintain the normal cell cycle and the integrity of the genome. Accordingly, the role of dNTP pool homeostasis was demonstrated in cancer development, aging, and viral infections. We developed experimental and bioinformatics tools to advance our understanding of the complex biochemical system of dNTP homeostasis. We improved a fluorescent dNTP measurement method and developed an automated kinetic analysis software that makes this otherwise complicated assay widely attainable. We built a dNTP pool database that contains dNTP concentrations measured in different species, cellular compartments, and conditions. It offers a pairwise comparison of any chosen pair of pools which allows quick detection of changes in dNTP levels upon stress, treatments, or altered genetic backgrounds. We created a kinetic model of dNTP homeostasis based on experimentally determined parameters, a formal description that reproduces both its qualitative and quantitative behavior to a reasonable level of approximation. We show that separate dNTP metabolic enzymes do not sustain the need for dNTPs for normal cell division. dNTP production is fast enough only if a kinetic coupling is realized between all major dNTP synthesis enzymes and if DNA replication centers are fueled by a localized dNTP pool replenished rapidly without coming into equilibrium with the rest of the cellular pool.
Full text https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=124527
Decision
Yes





 

List of publications

 
Rita Hirmondó, Ármin Horváth, Dániel Molnár, György Török, Liem Nguyen, Judit Tóth: The effects of mycobacterial RmlA perturbation on cellular dNTP pool, cell morphology, and replication stress in Mycobacterium smegmatis, PLoS One, 2022 Feb 24;17(2):e0263975. doi: 10.1371/journal.pone.0263975. eCollection 2022., 2022
Éva Viola Surányi, Rita Hírmondó, Kinga Nyíri, Szilvia Tarjányi, Bianka Kőhegyi, Judit Tóth and Beáta G. Vértessy: Exploiting a Phage-Bacterium Interaction System as a Molecular Switch to Decipher Macromolecular Interactions in the Living Cell, http://real.mtak.hu/79236/, 2018
Lopata Anna, Jójárt Balázs, Surányi Éva, Takács Enikő, Bezúr László, Leveles Ibolya, Bendes Ábris, Viskolcz Béla, Vértessy Beéta, Tóth Judit: Beyond Chelation: EDTA Tightly Binds Taq DNA Polymerase, MutT and dUTPase and Directly Inhibits dNTPase Activity, BIOMOLECULES 9: (10) p. 621., 2019
Judit Eszter Szabó, Éva Viola Surányi, Bence Sándor Mébold, Tamás Trombitás, Mihály Cserepes, Judit Tóth: A user-friendly, high-throughput tool for the precise fluorescent quantification of deoxyribonucleoside triphosphates from biological samples, https://academic.oup.com/nar/article/48/8/e45/5760754?login=true, 2020
Rita Pancsa, Erzsébet Fichó, Dániel Molnár, Éva Viola Surányi, Tamás Trombitás, Dóra Füzesi, Hanna Lóczi, Péter Szijjártó, Rita Hirmondó, Judit E Szabó , Judit Tóth: dNTPpoolDB: a manually curated database of experimentally determined dNTP pools and pool changes in biological samples, Nucleic Acids Res . 2022 Jan 7;50(D1):D1508-D1514. doi: 10.1093/nar/gkab910., 2021
Judit Eszter Szabó, Éva Viola Surányi, Bence Sándor Mébold, Tamás Trombitás, Mihály Cserepes, Judit Tóth: A user-friendly, high-throughput tool for the precise fluorescent quantification of deoxyribonucleoside triphosphates from biological samples, https://academic.oup.com/nar/article/48/8/e45/5760754?login=true, 2020





 

Events of the project

 
2020-02-11 09:32:07
Résztvevők változása
2019-07-17 23:31:32
Résztvevők változása




Back »