A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. A projekt átfogó célja olyan megbízható módszerek kidolgozása, amelyekkel a nőivar genetikai erőforrásai megőrizhetővé válnak különböző halfajokban, ezáltal számos biológiai modell, ökológiai fontosságú, természetvédelmi értéket képviselő vagy akvakultúrában jelentős faj és vonal génmegőrzése és tárolása kivitelezhetővé válna. Ez a következő módszerek optimalizálásával kerül megvalósításra: 1. Különböző fejlettségi stádiumban lévő oogóniumok és oociták nagy hatásfokú izolációs és szeparációs eljárásainak fejlesztése 2. Petefészek szövet és oociták hűtési érzékenységének vizsgálata rövid vagy meghosszabbított hűtve tárolás során 3. Különböző fejlettségi állapotú oociták kulcsfontosságú kriobiológiai paramétereinek meghatározása, majd ezt követően elméleti becslések az optimális hűtési / felolvasztási sebesség, nitrogénbe helyezés hőmérsékletének és védőanyag hozzáadásának és kivonásának protokolljai kapcsán 4. Elméleti becslések kiegészítése tapasztalati ellenőrzéssel és teljes petefészek szövet vitrifikációs protokollok fejlesztése 5. In vitro érlelés protokollok fejlesztése különböző fejlettségi stádiumú oocitákra 6. Petefészek eredetű ivarsejtek átültetése alkalmas recipiensekbe, valamint ezt követően donor eredetű ivarsejtek és utódok termeltetése a recipiensekkel
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. A különböző biotechnológiai kutatások során a halak modell szervezetként történő széleskörű felhasználásának, valamint a halak génmegőrzésének egyik fő korlátja a nőivarú genetiai erőforrások megőrzésére szolgáló módszerek hiánya. Napjainkig kizárólag sperma mélyhűtve tárolására feljesztettek eljárásokat, ezzel szemben a hal ikra és embrió esetében ez nem megoldott. A projekt célja a nőivarú genetikai erőforrások mélyhűtve tárolásának lehetővé tétele, korai stádiumú oociták mélyhűtésével, melyek kevésbé érzékenyek a hűtésre, mint az érett ikrák, a mélyhűtés szélsőséges környezeti hatásaival szemben ellenállóbbak. A kutatás további célja rávilágítani a kulcsfontosságú kérdésekre és korlátokra az alábbi terüleken: oociták és oogóniumok izolálása, szeparálása, hűtve tárolás lehetőségei, in vitro érlelés és ivarsejtek helyettesítő termelése oogónium átültetéssel.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! A gerinces modell szervezetek esetében az ivarsejtek és embriók mélyhűtve tárolásának kulcsfontosságú szerepe van a modellek költséghatékonyságára és eredményességére nézve. Továbbá számos vadon élő gerinces faj fenyegetett vagy veszélyeztetett, tehát a mélyhűtésnek kiemelet jelentősége van az érintett fajok genetikai diverzitásának megőrzésében. Napjainkig halfajok esetében kizárólag a hímivar genetikai információjának hosszútávú tárolása megoldott. Nőivarú genetikai állomány mélyhűtött génbankjainak létrehozásával, valamint módszerek fejlesztésével lényegesen könnyebbé válnak ezen fajok manipulációja. A mélyhűtve tárolás jelentősen csökkenti a transzgenikus állományok fenntartásának költség- és munkaerő igényét, a hagyományos tenyésztési eljárásokhoz képest (nagy létszámú tenyészállomány fenntartása), ezáltal lehetővé válik a források átcsoportosítása kutatási tevékenységekre. Egyúttal az állatjólétre is pozitív hatással van, mivel csökken a kutatóhelyen tartott állatok létszáma, jelentősen hozzájárulva ezzel a 3R (Replacement, Reduction and Refinement) céljainak megvalósuláshoz.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. Az utóbbi évtizedek során az antropogén tényezők nyomot hagytak a természetes környezetben. A klímaváltozás és a környezet általános degradációja többezer állatfaj vált fenyegetetté, veszélyeztetetté vagy halt ki. A következő generáció előállítására alkalmas sejtek (sperma, ikra, embrió) hűtve tárolása nagyban megkönnyíti a génmegőrzési munkát számos fajban, bár pillanatnyilag a hal ikra és embrió nem mélyhűthető, összetett szerkezetük és magas szik tartalmuk miatt. A nőivar genetikai erőforrásainak tárolására megoldást jelenthet a korai fejletttségi stádiumú oociták mélyhűtése, majd további érlelésük érett ikra stádiumig, ugyanis ezek az “éretlen” sejtek lényegesen jobban tolerálják magát a hűtést és a mélyhűtés okozta környezeti hatásokat. Ez a módszer új kihívások sorát nyitja meg, úgy mint a korai fejlettségi stádiumú oociták izolációja és a mélyhűtést követően funkcionális ikrává érlelése. Emiatt a kutatás fő célja korai fejlettségi állapotban lévő oociták mélyhűtési módszereinek kidolgozása, továbbá izolációs és szeparációs módszerek kidolgozása, végül funkcionáló ikrává érlelése in vitro szövettenyésztés vagy oogónium átültetés során. A fenti módszerek fejlesztése tökéletesítik a jelenleg elérhető génmegőrzési módszereket, valamint lehetővé teszik a genetikai erőforrások biztonságos tárolását a kutatóintézetekben, ezáltal is növelve azok költség- és munkaerő hatékonyságát.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. The overall objective of this project is to develop reliable methods for conservation of female genetic resources in fish which can be applied in conservation and storage of different fish species and lines with various biomedical, ecological, conservational or aquaculture interests. This will be accomplished by optimizing methods for the following specific project objectives: 1. Development of high-throughput methods for isolation and sorting of oogonia and oocytes of different developmental stages 2. Chilling sensitivity of ovarian tissue or separated oocytes to short or prolonged cold storage 3. Determination of key cryobiological parameters for oocytes of all developmental stages and subsequent theoretical prediction of optimal cooling / warming rates, plunging temperatures and cryoprotectant addition and removal protocols 4. Complementation of theoretical predictions with empirical verification and development of vitrification protocols for whole ovarian tissue 5. In vitro maturation protocols for oocytes of different developmental stages 6. Transplantation of ovarian germ cells into suitable recipients and subsequent production of donor-derived gametes and offspring by recipients
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. One of the main limitations in further biotechnological expansion and use of fish as model organisms, but also in fish species conservation, is the lack of methods for conservation of female genetic resources. Until now, only methods for cryogenic storage of spermatozoa have been developed, while cryopreservation of fish eggs and embryos is still not possible. This project aims to enable cryogenic storage of female genetic resources by cryopreserving early-stage oocytes which are less sensitive to chilling than mature eggs and which can withstand extreme environments produced by cryopreservation. The study further aims to elucidate the key questions and obstacles derived from such approach: isolation of oocytes and oogonia, their sorting, possibilities for chilled storage, in vitro maturation and surrogate production of gametes by oogonia transplantation.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. Cryogenic storage of germ cells or embryos from genetically altered, vertebrate model organisms has a key role in making the use of these models cost effective and efficient. Furthermore, many vertebrate species are threatened or endangered in the wild, therefore cryopreservation can have a significant role in preserving genetic diversity of threatened species. Until now, only preservation and long-term storage of male genetic information is possible in fish. Implementation of cryobanking of female genetic material in fish and development of methods which enable their use after warming will greatly facilitate all types of manipulations with such species. Cryogenic storage significantly reduces the funds and labor needed for keeping transgenic lines and broodstock in general compared to the traditional methods of keeping breeding colonies, which will in turn allow allocation of funds from maintenance into basic research activities. It also improves animal welfare by reducing the number of animals held in stock centers and laboratories and significantly contributes to the 3Rs (Replacement, Reduction and Refinement).
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. During the last few decades, anthropogenic factors have resonated through the natural environment. Climate changes and general degradation of the environment have left thousands of animal species vulnerable, endangered or even extinct. Cryobanking of cells (storing cells at subzero temperatures) which can readily produce the next generation (sperm, eggs, embryos) has been a great facilitating tool in conservation efforts of such species, however, currently cryobanking of fish oocytes and embryos is not possible due to high complexity and high yolk content. One approach which will enable the cryogenic storage of female genetic resources is cryopreservation of early development stage oocytes which mature into functional eggs since they are much more tolerable to cooling and harsh environments met by cells during cryopreservation. However, this approach opens new challenges such as isolation of early-stage oocytes and their maturation into functional eggs after cryopreservation. Therefore, the main aim of this study is to develop cryopreservation methods for cryobanking of early-stage oocytes, and methods which will allow their simple isolation and sorting, but also maturation into functional eggs through in vitro culture or by oogonial transplantation. Development of these methods will improve current conservation strategies, but also enable safe storage of genetic reasources in research institutes and stock centers which will be more cost- and labor-efficient.
Final report
Results in Hungarian
A projekt célja a halak oogóniális őssejtjeire és oocitáira alapozott technológiák kialakítása volt, ami hozzájárul a csontoshal-fajok nőivarú genetikai tartalékainak megőrzéséhez. Az enzimatikus emésztés helyett mechanikai elválasztással izoláltuk sikeresen a különböző fejlődési stádiumú zebradánió és ponty oocitákat. Az oociták hűtött tárolása fejlődési stádiumtól függő túlélést eredményezett. A korábbi fejlődési állapotú sejtek tovább őrizték meg életképességüket. A petefészek-szövetben hűtött tárolásakor az oogóniumok azokban a szövetekben mutatták a legmagasabb túlélést, amelyekben korábbi fejlődési stádiumú oociták domináltak. Az izolált oogóniumok hűtött tárolása tovább javította a túlélésüket. A halak oocitáinak és oogóniumainak mélyhűtése szintén fejlődési foktól függő túlélést eredményezett. A I. stádiumú oociták túlélése mérsékelt volt, ugyanakkor az angolna oogóniumainak kb. 95%-a túlélte a fagyasztást 1,5 M DMSO jelenlétében. A petefészek-szövet vitrifikációja szintén a sejtek nagy arányú túlélését eredményezte angolnában és tokfélékben. Afrikai harcsában a III. stádiumú oociták in vitro érlelése és ovulációja sikeres termékenyülést és embrionális fejlődést eredményezett. A lazacfélék oogóniumait sikerrel ültettük be megfelelő recipiensekbe. A beültetést követően ugyan gametogenezisre nem került sor a triploid recipiensekben, azonban a beültetett sejtek még 3 évvel a transzplantációt követően is kimutathatók voltak bennük.
Results in English
In this project we concentrated on the development of technologies using fish oogonial stem cells (OSCs) and oocytes for the conservation of female genetic resources in teleost fish. Mechanical separation was used to isolate zebrafish and common carp oocytes of different developmental stages instead of enzymatic digestion. Hypothermic storage of oocytes resulted in a stage-specific survival with cells in earlier developmental stages retaining their viability for a longer time. Similarly, OSCs preserved their viability for a longer period (up to 7 days) in ovarian tissue fragments containing earlier developmental stages of oocytes. This was further improved using isolated OSCs in a suspension. Cryopreservation of fish oocytes and OSCs yielded stage-specific results. While the survival of stage-I oocytes was moderate, approximately 95% viability was recorded when European eel OSCs were frozen in the presence of 1.5 M Me2SO. Vitrification of ovarian tissue also yielded satisfactory OSC survival in the eel and sturgeon. Successful in vitro maturation (IVM) and ovulation of stage-III oocytes was achieved in the African catfish resulting in fertilization and embryonic development. Transplantation of salmonid OSCs into suitable recipient larvae resulted in successful colonization of the recipient gonad by the donor-derived cells. Although gametogenesis was not initiated in the triploid recipients, the presence of donor-derived cells 3 years post transplantation was demonstrated.
Lujić J., Marinović Z., Kása E., Šćekić I., Urbányi B., Horváth Á.: Preservation of common carp germ cells under hypothermic conditions: whole tissue vs isolated cells, Reproduction in Domestic Animals, 2018
Lujić J., Marinović Z., Sušnik Bajec S., Djurdjevič I., Urbányi B., Horváth Á.: Interspecific germ cell transplantation: a new light in the conservation of valuable Balkan trout genetic resources?, Fish Physiology and Biochemistry, 2018
Šćekić I., Kitanović N., Marinović Z., Müller T., Urbányi B., Lujić J., Horváth Á.: Preservation of ovarian tissue in European eel (Anguilla anguilla), Abstract book. 7th International Workshop on the Biology of Fish Gametes, 2019
Scekic I., Marinovic Z., Müller T., Urbányi B., Horváth Á., Lujic J.: CRYOPRESERVATION AS A FIRST STEP IN THE EUROPEAN EEL CONSERVATION EFFORTS, Abstract book. 56TH ANNUAL MEETING OF THE SOCIETY FOR CRYOBIOLOGY, 2019
Šćekić I., Lujić J., Herranz-Jusdado J. G., Marinović Z, Urbányi B., Asturiano J. F., Horváth Á.: New strategy for conservation of European eel, Abstract book. International conference: Adriatic Biodiversity Protection, 2019
