 |
Role of tethering factors in the fusion of early endosomes
|
Help 
Print 
|
Here you can view and search the projects funded by NKFI since 2004
Back »
|
| |
Details of project |
|
|
| Identifier |
124594 |
| Type |
PD |
| Principal investigator |
Simon-Vecsei, Zsófia |
| Title in Hungarian |
Pányvázó faktorok szerepe korai endoszómák fúziójában |
| Title in English |
Role of tethering factors in the fusion of early endosomes |
| Keywords in Hungarian |
endoszóma, pányvázó faktor, vezikulafúzió |
| Keywords in English |
endosome, tethering factor, vesicle fusion |
| Discipline |
| Molecular biology (Council of Medical and Biological Sciences) | 60 % | | Ortelius classification: Molecular biology | | General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences) | 40 % | | Ortelius classification: Biochemistry |
|
| Panel |
Cellular and Developmental Biology |
| Department or equivalent |
Department of Anatomy, Cell and Developmental Biology (Eötvös Loránd University) |
| Participants |
Ürmösi, Adél
|
| Starting date |
2017-10-01 |
| Closing date |
2021-03-31 |
| Funding (in million HUF) |
15.405 |
| FTE (full time equivalent) |
4.20 |
| state |
closed project |
Summary in Hungarian A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
Jelen pályázatom során a pányvázó faktorok korai endoszómák fúziójában betöltött szerepét kívánom vizsgálni. A pányvázó faktorok fontos szereplői a vezikulafúziós eseményeknek, mivel közel pozicionálják a donor és az akceptor membránokat, így felgyorsítják a folyamatot. Az endoszómális transzport mechanizmusok szigorú kontroll alatt állnak, defektusaik az általuk szállított anyagok hibás felhalmozódását okozzák, a folyamatban részt vevő fehérjék mutációja súlyos neurodegeneratív betegségek kialakulásához vezethet. Munkacsoportunk nemrégiben azonosított egy, a korai endoszómák fúziójában részt vevő pányvázó komplexet, a miniCORVET-et, melynek a Drosophila vér- és vesesejtjeiben van funkciója. Terveim közt szerepel ezen komplex, és egy másik korai pányvázó faktor, a Rabenosyn-5 kapcsolatának vizsgálata. Ehhez a miniCORVET alegységeinek, illetve a Rabenosyn -5-nek a géncsendesítését, majd ezt követően fagocitózis esszét kívánok beállítani olyan sejtekben, melyekben megnövekedett endocitotikus aktivitás zajlik, azaz makrofágokban és mikroglia sejtekben. Ezen kívül az emlős CORVET komplex alegységeit kívánom azonosítani az említett sejttípusokban. In vitro fehérje-fehérje interakciós vizsgálatokban a Vps18 miniCORVET alegység, illetve a Rabenosyn-5 közötti kötést szeretném kimutatni, a fehérjék kötőhelyeit azonosítani. Eredményeink elősegíthetik az endoszómális transzport folyamatok, a pányvázó faktorok és a vezikulafúziós események részletesebb megismerését, különös tekintettel az általunk használt sejtféleségekben megfigyelt folyamatok sejtspecifikus voltára.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
A Drosophila Vps8 fehérjéje, amely egy CORVET-specifikus alegység, főleg a muslica vér- és vesesejtjeiben expresszálódik, mely sejtek magas endocitotikus aktivitást mutatnak. Ezek a sejtek a mikrobákat és sejttörmeléket bekebelező humán makrofágoknak, valamint a vese proximális tubulussejtjeinek, illetve a podocitáknak felelnek meg. Ezen hasonló funkciók alapján szeretnénk választ találni az alábbi kérdésekre: mi a szerepe az emlős CORVET komplexnek a magas endocitotikus aktivitású sejtekben? A kérdés megválaszolására a CORVET alegységeit kódoló gének csendesítését végezzük makrofágokban és mikroglia sejtekben, majd azok fagocitózisát fogjuk vizsgálni. Ezt követően arra keressük a választ, hogy hogyan tud a Drosophila miniCORVET komplex, amely az élesztő és a humán komplex csonkolt változata, pányvázó faktorként funkcionálni? Feltételezésünk szerint a miniCORVET egyik alegysége, a Vps18 egy másik korai endoszómális pányvázó fehérjével, a Rabenosyn-5-tel lép kapcsolatba ahhoz, hogy ellássa szerepét a fent említett sejttípusokban. Az interakciót in vitro kötődési esszékben rekombináns Drosophila fehérjékkel kívánjuk bemutatni, illetve a fehérjék kötőhelyeit azonosítani. Ezen kívül szeretnénk vizsgálni, hogy a Vps18-Rabenosyn-5 közötti kölcsönhatás létrejön-e emlős sejtekben is, illetve szeretnénk azonosítani a makrofágokban és mikroglia sejtekben előforduló CORVET komplex alegységeit. Ehhez humán rekombináns fehérjéket fogunk alkalmazni a kötődési esszékben, illetve az említett emlős sejtekben előforduló komplexet tag-gel ellátott Vps8 fehérje kikötésével feldúsítjuk, majd kötőpartnereit, azaz a komplex alegységeit, tömegspektrometriai analízissel azonosítjuk.
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
Az eukarióta sejtek sajátossága a kompartmentalizáltság, mely megkívánja az egyes organellumok közötti fehérje- és lipidtranszport fenntartását. Ezt biztosítják a transzport vezikulák, melyek egy kiinduló membránból formálódnak, majd egy donor membránnal képesek fuzionálni. Ez utóbbi folyamatot egy konzervált fúziós szerkezet segíti elő, mely a membránkötött Rab-GTPázokból, azok effektoraiból - mint például a pányvázó faktorok-, valamint mindkét membránban megtalálható SNARE fehérjékből áll. A pányvázó faktorok működése elengedhetetlen a fúzióban, mivel a folyamat sebesség-meghatározó lépéseit gyorsítja fel: ilyenek a vezikulák toborzása, pozicionálása, a transz-SNARE fehérjekomplexek összeszerelődésének elősegítése, valamint a vezikulák megfelelő sejtkompartmentbe való juttatása. Ezek alapján a pányvázó faktorok szerkezetének és funkciójának feltérképezése fontos aspektus a sejtek működésének megismerésében. A pányvázó faktorok lehetnek monomerek, de működhetnek nagyméretű fehérje komplexekként is, ami megnehezítheti vizsgálatukat. Célul tűztük ki az emlős korai endoszómális pányvázó faktor, a CORVET vizsgálatát, szem előtt tartva a munkacsoportunk által Drosophilában azonosított miniCORVET komplexről szerzett információkat. A miniCORVET működése elengedhetetlen a muslica nagy endocitotikus aktivitást mutató vér- és vesesejtjeiben, ez alapján az emlős komplexet is hasonló funkciójú sejttípusokban: makrofágokban és mikroglia sejtekben kívánjuk vizsgálni. Feltételezésünk szerint a komplexnek ezen sejttípusokban van kiemelt szerepe, így érdemes a kísérletekben ezeket a sejteket alkalmazni, ellentétben a korábbi tanulmányokban megjelent HeLa sejteken alapuló eredményekkel. Az említett sejtféleségek az emlős immunrendszer tagjai, amely felveti a lehetőséget, hogy a komplex működése fontos a védekező rendszer fenntartásában is. Ezen felül az endoszómális útvonalakban részt vevő fehérjék mutációja súlyos neurológiai betegségeket okozhatnak, ami alapján lehetséges, hogy a központi idegrendszerben előforduló mikroglia sejtek felhasználhatók az ilyen típusú betegségek modellezésére. Eredményeink elősegítik a pányvázó faktorok részletesebb megismerését, különösen annak adott sejttípusokban betöltött szerepére fókuszálva.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
Az eukarióta sejtek sajátossága a kompartmentalizáltság, mely megkívánja az egyes sejtszervecskék közötti fehérje- és lipidtranszport fenntartását. Ezt biztosítják a transzport vezikulák, melyek egy kiinduló membránból formálódnak, majd egy donor membránnal képesek fuzionálni. Bonyolult fúziós szerkezetek összehangolt működése biztosítja a két membrán összeolvadását, és ha valamelyik lépés zavart szenved, az súlyos neurológiai betegségek kialakulásához vezethet. Kutatásaink során a fúziós masinéria két tagjának vizsgálatát tervezzük makrofágokban és mikroglia sejtekben: amelyek a CORVET fehérjekomplex és Rabenosyn-5 fehérje. Az említett sejttípusok az emlős immunrendszer tagjai, és képesek mikróbák, sejttörmelék és idegen anyagok bekebelezésére. Ennek következtében nagyszámú nagyméretű vezikulát tartalmaznak, amelyek fúziója speciális fúziós faktorok működését követelheti meg. Szeretnénk kimutatni, hogy a CORVET és a Rabenosyn-5 képes egymáshoz kapcsolódni, és ezt a kötődést képesek vagyunk leegyszerűsített módon kémcsőben modellezni Drosophila és humán fehérjék felhasználásával. Ezen kívül a muslica és az emberi CORVET komplexek alegységeit is szeretnénk azonosítani, és összehasonlítani. Eredményeink alapján betekintést nyerhetünk a sejtspecifikus vezikulafúzió folyamatába.
| Summary Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
In my proposal I present a plan for investigation of the role of tethering factors in the fusion of early endosomes. Tethering factors are important participants in vesicular fusion events by bring the donor and acceptor membranes into contact and thus facilitates the process. The endosomal transport mechanisms are under tight regulation and disruptions in them lead to defective cargo delivery. Mutations in proteins that control these pathways can cause severe neurological and neurodegenerative diseases. Recently we identified an early endosomal tethering complex, the miniCORVET, which has a role in hemocytes and nephrocytes in Drosophila. In our future work we will focus on the relationship between this complex and the Rabenosyn-5 protein. We will carry out phagocytosis assays after knock-down of the subunits of miniCORVET and Rabenosyn-5 to study their role in mammalian cells with elevated phagocytic capacity: in macrophages and in microglia. We reveal the subunits composition of mammalian CORVET complex in the above mentioned cell types. We will investigate the proposed interaction between miniCORVET subunit Vps18 and Rabenosyn-5 using recombinant purified Drosophila and human proteins in in vitro binding assays. Our work can facilitate further understanding of endosomal trafficking, tethering complexes and vesicle fusion, with a strong emphasis on tissue-specific regulatory mechanisms.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
In Drosophila, the CORVET-specific Vps8 is expressed mainly in hemocytes and nephrocytes, and these cells show the highest endocytic activity in fly. In human these cells correspond to macrophages that can engulf e.g. microbes and cellular debris, and to the highly endocytic renal proximal tubule cells and podocytes that have a similar glomerular ultrafiltration membrane as fly nephrocytes. Given these similar functions, we would like to answer the question: what is the role of the mammalian CORVET complex in cell types with elevated endocytic activity? We will investigate the phagocytic activity of macrophages and microglia cells lacking CORVET subunits to address this question. Next we would like to know how can Drosophila miniCORVET, which is a truncated version of the yeast and mammalian complex, function as a tether? According to our hypothesis Vps18, which is a subunit of miniCORVET binds another early endosomal tether Rabenosyn-5, which binding is necessary for proper homotypic fusion of early endosomes in the above mentioned cell types. We intend to prove the interaction using recombinant proteins in in vitro binding assays. We also want to know, if this binding occur in mammals as well and what is the subunit composition of mammalian CORVET in macrophages and microglia? For this we will use human recombinant proteins in the binding assays and we will enrich the CORVET via tagged Vps8 subunit and identify its binding partners with mass spectrometry.
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
Eukaryotic cells have to maintain constant flux of proteins and lipids between different organelles, which is sustained by transport vesicles that are formed at a donor membrane and fuse with the acceptor membrane. This latter process is supported by a conserved fusion machinery that consists of Rab-GTPases, their interacting effectors, such as tethering factors and SNARE proteins on both membranes. Tethering factors are essential in the fusion event, since they accelerate rate-limiting steps, such as vesicle capture, control and direct SNARE activity, and they may help guarantee that vesicles deliver their cargo to the correct compartment. These issues provide needs to elucidate the structure and function of tethering factors. These proteins can act as monomers, or as large multisubunit complexes as well, which makes their study often challenging. In spite of this we attempt to investigate mammalian early endosomal tethering complex CORVET in line with the recently identified Drosophila miniCORVET, which function is indispensable in cell types with high endocytic activity: in hemocytes and nephrocytes. In our study we focus on the role of CORVET in the corresponding mammalian cells, such as macrophages and microglia. We hypothesize that the complex has main role in these cell types, and it is worthwhile to plan experiments with cells with elevated endocytic activity –rather in earlier studies where HeLa cells were used. These cell types are members of the immune system, so it raises the possibility that these tethering factors have role in maintaining mammalian defensive system as well. Moreover mutations in proteins that control endosomal pathways can cause severe neurological and neurodegenerative diseases, which propose the usage of microglia as a tool in modeling such disorders. Our work can accelerate the broadening of our knowledge on vesicle fusion, endosomal trafficking and tethering complexes particularly focusing on tissue-specific regulatory mechanisms.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
Eukaryotic cells have to maintain constant flow of proteins and lipids between their compartments. For this purpose transport vesicles are formed and fuse with a target membrane to fulfill their role. Difficult machinery ensures the fusion of two membranes and if it is altered, it can cause severe neurological diseases. During our research we investigate the roles of two members of the fusion machinery – the CORVET protein complex and Rabenosyn-5 protein- in macrophages and microglia cells. These cell types are part of the mammalian immune system and they can engulf microbes, cellular debris or foreign substances. That is why they contain numerous enlarged vesicles, and their fusion may need special factors. We determine the relationship of the two vesicular fusion factor CORVET and Rabenosyn-5 in macrophages and microglia and we intend to detect that these proteins can interact. We can simplify the binding process in test tubes and we will use Drosophila and human proteins to mimic the situations happened in the cells. We would also determine if Drosophila and mammalian CORVET consist of the same subunits. With our research we can have new insights in the process of vesicle fusion in tissue-specific manner.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
