Biophysics (e.g. transport mechanisms, bioenergetics, fluorescence) (Council of Medical and Biological Sciences)
40 %
Ortelius classification: Biophysics
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)
30 %
Ortelius classification: Enzimology
Molecular biology (Council of Medical and Biological Sciences)
30 %
Ortelius classification: Molecular biology
Panel
Molecular and Structural Biology and Biochemistry
Department or equivalent
Department of Biophysics and Cell Biology (University of Debrecen)
Participants
Csősz, Éva Gyöngy, Zsuzsanna Kalló, Gergő Ritter, Zsuzsanna Szabó, Gábor Szakács, Gergely Tarapcsák, Szabolcs
Starting date
2017-09-01
Closing date
2023-03-31
Funding (in million HUF)
47.997
FTE (full time equivalent)
9.96
state
running project
Final report
Results in Hungarian
Két orvosi szempontból fontos emberi ABC transzporter az ABCG2 és az ABCB1 működési mechanizmusát vizsgáltuk, hogy elősegítsük a racionális gyógyszertervezést. A nukleotid-kötőhelyek konzervált szekvenciáiban mutációkat hordozó ABCB1 variánsokat tanulmányozva megállapítottuk, hogy a szerkezetileg szimmetrikus ATP-kötőhelyek felváltva, véletlen sorrendben végzik az ATP hidrolízisét. A pszeudo-szimmetrikus transzmembrán domének által kialakított szubsztrát-kötő zsebhez egyszerre két különböző ligand is kötődhet, mely bizonyos ligand-kombinációk esetén erős transzport gátlást okoz.
Az ABCG2 működési mechanizmusára vonatkozó biofizikai és biokémiai vizsgálatok eredményei ellentmondásosak és nincsenek összhangban a krio-EM adatokkal. Figyelembe véve az ABC transzporterek érzékenységét membrán környezetükre feltételezhető, hogy a kísérleti eredmények inkoherenciáját a modell rendszerek különbözősége okozza. Ezért olyan fluoreszcencia-alapú módszereket fejlesztettünk ki, melyek lehetővé teszik az ABCG2 vizsgálatát a sejtek plazmamembránjában természetes lipid környezetükben. Bizonyítottuk, hogy összhangban a krio-EM adatokkal, az ABCG2 citoplazma felé nyitott magas szubsztrát-affinitású konformációjából az extracelluláris tér felé nyitott alacsony szubsztrát-affinitású konformációba történő átbillenését az ATP kötődése idézi elő, míg a citoplazma felé nyitott állapotba történő visszatéréshez az ATP hidrolízise és a hidrolízis termékek disszociációja szükséges.
Results in English
To promote rational drug design we have studied the working mechanism of two medically important ABC transporters ABCG2 and ABCB1. By studying nucleotide binding site mutant ABCB1 variants we have demonstrated that the structurally symmetric ATP binding sites are committed for ATP hydrolysis in a strictly alternating order. On the other hand, the pseudo-symmetric transmembrane domains can bind two ligands simultaneously leading to a strong synergistic ABCB1 inhibition in case of certain ligand combinations.
The results of previous biophysical and biochemical experiments corresponding to the functioning of ABCG2 are often controversial and conflict with recent high resolution cryo-EM structures, probably because of the different plasma membrane composition of the applied experimental systems. To overcome this problem we have developed state of the art fluorescence-based methods for studying ABCG2 in the plasma membrane in its natural lipid environment. We have demonstrated in accordance with cryo-EM data that ATP binding is sufficient to switch ABCG2 from the high substrate affinity inward facing to the low substrate affinity outward facing conformation. On the other hand, hydrolysis of ATP and the subsequent dissociation of the hydrolysis products allows ABCG2 to revert to its high substrate affinity inward facing conformation to initiate a new transport cycle
