 |
Exploring novel roles of homologous recombination factors through genetic studies of mutagenesis
|
Help 
Print 
|
Here you can view and search the projects funded by NKFI since 2004
Back »
|
| |
Details of project |
|
|
| Identifier |
124881 |
| Type |
K |
| Principal investigator |
Szüts, Dávid |
| Title in Hungarian |
Homológ rekombinációs fehérjék új funkcióinak kutatása a mutagenezis genetikai vizsgálatával |
| Title in English |
Exploring novel roles of homologous recombination factors through genetic studies of mutagenesis |
| Keywords in Hungarian |
Homológ rekombináció, mutagenezis, sejtvonal-genetika |
| Keywords in English |
Homologous recombination, mutagenesis, cell line genetics |
| Discipline |
| Cell genetics (Council of Medical and Biological Sciences) | 40 % | | Ortelius classification: Molecular genetics | | Molecular biology (Council of Medical and Biological Sciences) | 30 % | | Ortelius classification: Molecular biology | | Genomics, comparative genomics, functional genomics (Council of Medical and Biological Sciences) | 30 % |
|
| Panel |
Cellular and Developmental Biology |
| Department or equivalent |
Institute of Molecular Life Sciences (Research Center of Natural Sciences) |
| Participants |
Csabai, István
Gervai, Judit Zsuzsanna
Németh, Eszter
Pipek, Orsolya Anna
Póti, Ádám
Szeltner, Zoltán
|
| Starting date |
2017-10-01 |
| Closing date |
2021-09-30 |
| Funding (in million HUF) |
47.998 |
| FTE (full time equivalent) |
8.44 |
| state |
closed project |
Summary in Hungarian A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
A genom stabilitásának megőrzéséért a DNS hibajavítás felelős. Az egyes DNS hibajavító mechanizmusok elvesztése különböző mutagén fenotípusokban nyilvánul meg, így a mutagén folyamatok azonosítása segíthet feltárni a DNS hibajavítás útvonalait. Kifejlesztettünk egy teljes genom szekvenáláson alapuló módszert, mely lehetővé teszi, hogy pontosan meghatározhassuk a mutációs terhelést, és a báziscserék és inzerciók/deléciók mintázatát. Egy általánosan használt DNS hibajavítás modellt, a csirke DT40 sejtvonalat alkalmaztuk, és humán knockout (KO) sejtvonalakban ellenőriztük eredményeinket. A megfelelő bioinformatikai eszközök kifejlesztése után bemutattuk, hogy ez a rendszer alkalmas az emberi testi- és ráksejtek mutációs mintázatainak modellezésére.
Ebben a munkában azokat a báziscserét okozó mechanizmusokat fogjuk vizsgálni kettős KO sejteken, melyek a BRCA1 és BRCA2 homológ rekombinációban (HR) részt vevő fehérjék hiányában keletkeznek, különös tekintettel az elakadt és összeomlott replikációs villa báziscseréket indukáló hatására. A mutációs mintázatok alapján tervezzük felderíteni a BRCA1, BRCA2 és RAD51 paralógok, és egyéb fehérjék szerepét a HR-ben, és eredményeinket széles körű molekuláris- és sejtbiológiai, valamint biokémiai vizsgálatokkal fogjuk alátámasztani. Végezetül, a nyilvános emberi tumorsejt genomokban azonosított HR-specifikus mutációs mintázatok segítségével eredményeinket validálhatjuk és kiegészíthetjük, valamint választ kaphatunk arra, hogy az azonosított mutációs mintázatok mekkora HR aktivitásra utalnak egyes daganatokban, és hogy milyen HR-t célzó terápiákra van potenciális lehetőség.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
A projekt elsődleges kérdése, hogy a homológ rekombinációs (HR) faktorok több különböző szerepet töltenek-e be a genom stabilitás fenntartásában. Működő hibajavító mechanizmusok hiányában a DNS sérülések mutációkat okozhatnak: bázisváltozásokat, rövid inzerciókat és deléciókat, valamint kromoszóma-átrendeződéseket. Hipotézisünk szerint a BRCA1 és BRCA2 homológ rekombinációs faktorok hiányában megfigyelt báziscserével járó mutagenezist az elakadt replikációs villa menekítéséért és a DNS replikáció befejezéséért felelős folyamatok okozzák. Szeretnénk feltérképezni, hogy a mutációk eredete a mutagenikus transzléziós szintézis, amely egy alternatív lézió kikerülő mechanizmus, vagy a DNS szintézis, amely a homológ rekombináció hiányában az összeomlott replikációs villa javítását végző nem homológ végek összeillesztése során következik be, vagy az abnormális DNS szintézis a HR fehérjék által nem védett, megakadt, visszafordult replikációs villáknál.
A következő kérdés, hogy a különböző HR faktorok eltérő szerepet játszanak-e a genomintegritás megóvásában. Különösen a BRCA1 és a BRCA2 különböző mutagenikus fenotípusai valamint a RAD51 paralóg fehérjék hatásai állnak érdeklődésünk központjában.
Végül arra keressük a választ, hogy az azonosított koncepcióink alkalmasak-e személyre szabott daganatterápiára. Daganatos genomokban fogunk HR hiányára utaló specifikus mutációs profilokat keresni és megvizsgálni, hordozzák-e ezek a minták hibajavító gének ismert mutációit. Amennyiben a sejtek egyedi mechanizmusai hibásak, eltérően reagálnak a DNS-károsító kemoterápiákra. A DNS-javító folyamatokban azonosított hiba felhasználható a megfelelő kezelés kiválasztására.
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
A tervezett munka kiváló példája az alkalmazható eredményeket ígérő alapkutatásnak, a sikertelen DNS-javítás következményeinek feltérképezésével, és javaslatokkal az eredmények klinikai alkalmazására.
A DNS-javító folyamatok hibáiból eredő genomiális instabilitást megfigyelték többféle mutációs riporter esszével, valamint betegekből származó, DNS-javító génhibákat tartalmazó mintákban. Azonban ezek a megfigyelések nem összevethető módon készültek, valamint nem terjednek ki a genominstabilitás minden aspektusára. Az új generációs egész genom szekvenálási technológia segítségével fel tudtunk állítani egy olyan, sejtvonalakon alapuló esszét, melyben részletes és pontos mutációs mintázatot rendelhetünk mindegyik DNS-javító folyamat hiányához. Ez elsősorban új ismereteket fog nyújtani a homológ rekombináció (HR) mechanizmusáról, az alapkutatást előremozdítva. Azonban az eredmények a HR génekben mutációkat hordozó emberekben kifejlődő daganatokról szóló fontos kérdéseket is megválaszolnak.
A rákos betegek prognózisa lényegesen javult az elmúlt évtizedekben, de a a rákkutatás eredményei alapján várt áttörés még nem következett be. A biológiai kezelések még nem gyakoriak, a kemoterápia alkalmazása pedig még mindig főként empirikusan kifejlesztett protokollok szerint történik. A daganatok molekuláris tulajdonságai alapján választott személyre szabott terápia növelheti a várható túlélést és életminőséget, valamint csökkentheti a mellékhatásokat és a kezelés költségeit a hatástalan terápiák előzetes kiszűrésével. A tervezett kutatás a daganatkezelés személyre szabását igyekszik elősegíteni.
Hamarosan elérhető költségű lesz daganatsejtek teljes genomszekvenálása. A információ felhasználásához meg kell értenünk a tumorsejtek genomiális instabilitásának okait. Kutatásunkkal azt tervezzük bebizonyítani, hogy HR hibái felismerhetők a genomi mutációs mintázatok alapján. Ez lényeges, mert a HR aktivitás lényegesen befolyásolja a DNS-károsító szerek (pl. cisplatin) hatását, melyek a kemoterápiák alappillérei. Emellett a DNS-javító folyamatok a biológiai terápiáknak is ígéretes célpontjai, ezért a daganatsejtek DNS-javító képességeinek ismerete elengedhetetlen lesz a legjobb kezelés kiválasztásához.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
A sejtek örökítőanyaga folyamatosan károsodásoknak van kitéve, ezért a sejtekben többféle mechanizmus létezik a sérülések kijavítására. A javító mechanizmusok hiányában a túlélő sejtek DNS-ében mutációk keletkeznek, azaz megváltozik a sejt örökítőanyaga. A mutációk lehetnek egyszerű bázisváltozások, rövid beilleszkedett vagy kitörlődött szekvenciák, avagy egész kromoszómaszakaszok különféle nagyléptékű átrendeződései. A mutációk megváltoztathatják a sejt működését. Ez ivarsejtekben öröklődik, testi sejtekben pedig a rák kialakulásának alapvető okát jelenti.
A tervezett munkához kifejlesztettünk egy kísérleti módszert, melynek segítségével feltérképezhetjük a különböző DNS-javító mechanizmusok hiányában keletkező mutációkat. Ezt egy tenyésztett sejtvonal fontos DNS-javító génjeinek kiütésével érjük el. A mutációkat a sejtek teljes genomszekvenciájának meghatározásával találjuk meg, új generációs DNS szekvenálási technológiával. Újonnan kifejlesztett bioinformatikai módszerekkel azt tervezzük bebizonyítani, hogy a különböző DNS-javító folyamatok hiánya eltérő mutációs mintázatokat okoz. Ezután azt vizsgáljuk, hogy miként keletkeznek a kimutatott mutációk.
Az eredmények kettős jelentősséggel bírhatnak. Az alapkutatásban jobban megérthetjük a homológ rekombináció nevű DNS-javító folyamat működését, mely daganatokban gyakran nem működik. Ezen túl munkánk fontos előrelépéshez vezethet a személyre szabott rákterápiában, melyhez a jövőben várhatóan a daganatok genomjának analízise lesz a legfontosabb diagnosztikai módszer. A DNS-javító folyamatok hibáira jellemző mutációs mintázatok felismerése segíthet a leghatékonyabb kemoterápiás és biológiai kezelés kiválasztásában.
| Summary Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
DNA repair protects cells from genome instability. The loss of distinct DNA repair activities cause different mutagenic phenotypes, therefore the characterisation of mutagenic processes helps understanding the mechanisms of DNA repair. We have developed an assay based on whole genome sequencing that allows us to precisely determine mutation load, base substitution profiles and insertion/deletion patterns. We take advantage of the chicken DT40 cell line, a commonly used genetic model system for DNA repair, and confirm results in human knockout cells. Following the development of bioinformatic tools we demonstrated that this system reproduces the spontaneous mutation patterns of human somatic and cancer cells.
In this work, we will examine the mechanism of base substitution mutagenesis seen in the absence of the BRCA1 and BRCA2 homologous recombination (HR) proteins, creating a number of double knockout cell lines to genetically test distinct hypotheses. In particular, we will test how the stalling or collapse of DNA replication forks can lead to base substitution mutagenesis. We will also conduct a mutagenesis-based study on the mechanism of HR, exploring the different roles of BRCA1, BRCA2, RAD51 paralogs and further HR factors. Our studies will be backed by a wide range of molecular, cell biological and biochemical experiments. Finally, we will look for the presence of HR-specific mutational signatures in published human cancer genome sequences to aid the interpretation of our results on HR, and to assess the potential of using the identified genomic mutation patterns for the measurement of HR activity in tumours and for the prediction of HR-directed treatments.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
The primary question of this project is whether homologous recombination factors have multiple and distinct roles in guarding genome stability. In the absence of functioning DNA repair, DNA lesions can cause mutations such as base substitutions, short insertions and deletions, or chromosome-scale rearrangements. Our hypothesis is that the base substitution mutagenesis observed in the absence of homologous recombination factors BRCA1 and BRCA2 arises from events that rescue and complete DNA replication following replication fork stalling. We wish to know whether mutations arise from the over-use of mutagenic translesion synthesis that provides an alternative lesion bypass mechanism, or by DNA synthesis during non-homologous end joining that repairs collapsed replication forks in the absence of HR, or as a third alternative by abnormal DNA synthesis at stalled, potentially reversed, replication forks that are not protected by HR proteins.
We next ask if different HR factors have different roles in protecting genome integrity. We are particularly interested in the cause of the different mutagenic phenotypes of BRCA1 and BRCA2, and the roles of the RAD51 paralog proteins.
Finally, we will ask if the identified concepts are applicable in personalised cancer therapy. We will look for the presence of HR defect specific mutational profiles in cancer genomes, and ask whether the mutational signatures are identifiable in samples with known mutations in repair genes. As cells defective for individual mechanisms respond differently to DNA damaging chemotherapies, identfication of DNA repair defects could be used for treatment selection.
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
The proposed work presents an excellent example of basic research with readily applicable results, by mapping and explaining the consequences of failed DNA repair, and suggesting ways of utilising this information clinically.
Genome instability arising from the defect of DNA repair mechanisms has been observed using various experimental mutation reporters, and even in samples from patients with defects of DNA repair genes. However, this range of observations was not made in a comparable manner, and did not extend to all aspects of genome instability. Next generation whole genome sequencing allowed us to set up a cell line based assay in which we can attribute accurate mutational signatures to the defect of each repair pathway. This will primarily provide novel insights into the mechanism of homologous recombination repair (HR), advancing basic science. The results will also answer crucial questions on the development of tumours in the carriers of HR gene mutations.
The prognosis of cancer patients has improved considerably in the last decades, but the breakthrough expected to follow the results of cancer research has not happened yet. Biological treatments are rare, and chemotherapy is still mainly selected based on empirically developed protocols. Personalised therapy based on the molecular properties of individual tumours would increase survival and life quality, and reduce side effects and treatment cost by prior elimination of ineffective therapies. The results of the proposed work can help the personalisation of cancer treatment.
The full genome sequence of tumour cells will soon be obtainable at an affordable cost. To make use of this information we must understand the underlying molecular causes of tumour cell genome instability. This work aims to demonstrate that defective HR is identifiable based on specific genomic mutational signatures. This is significant, as the activity of HR strongly influences the response to DNA damaging agents (e.g. cisplatin), which are a mainstay of cancer chemotherapy. In addition, DNA repair processes are promising targets for biological therapy, and the knowledge of the DNA repair capabilities of tumour cells will be essential for chosing the best treatment.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
The genetic material of cells is constantly subjected to damage, therefore cells are equipped with a number of mechanisms that can repair this damage. In the absence of repair mechanisms, DNA damage in surviving cells gives rise to mutations, a change in the genetic material. Mutations can be the change of single bases, short deletions or insertions of sequences, and various large scale rearrangements of chromosome sections. The mutations may change the function of the cells, which is inheritable in germ cells, while in body cells it is the primary cause of cancer.
For the proposed work we developed a method to map the mutations that result from the inactivation of different DNA repair mechanisms, achieved by knocking out key DNA repair genes in a cultured cell line. The arising mutations will be detected by sequencing the whole genome of the cells, taking advantage of next generation DNA sequencing technologies. Using newly developed bioinformatic methods, we aim to show that the inactivation of different DNA repair processes give rise to distinct mutation patterns. We will then investigate how these mutations arise.
The significance of the results will be twofold. In basic research, we will better understand the workings of a DNA repair mechanism named homologous recombination, which is known to be frequently defective in cancer. In addition, our work can help the development of personalised cancer treatments, where the genomic analysis of tumours is likely to be the main diagnostic method in the near future. The identification of DNA repair defect specific mutational patterns can help with choosing the most effective chemotherapeutical or biological treatment.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
