 |
Preparation and cell membrane delivery of cholesteryl lipoproteins
|
Help 
Print 
|
Here you can view and search the projects funded by NKFI since 2004
Back »
|
| |
Details of project |
|
|
| Identifier |
124952 |
| Type |
K |
| Principal investigator |
Tömböly, Csaba |
| Title in Hungarian |
Koleszteril lipoproteinek előállítása és sejtmembránba juttatása |
| Title in English |
Preparation and cell membrane delivery of cholesteryl lipoproteins |
| Keywords in Hungarian |
szintézis, peptid, biokonjugáció, fluoreszcens jelölés, lipid, fehérje |
| Keywords in English |
synthesis, peptide, bioconjugation, fluorescent labelling, lipid, protein |
| Discipline |
| Organic, Biomolecular, and Pharmaceutical Chemistry (Council of Physical Sciences) | 90 % | | Ortelius classification: Intelligent materials | | Organic, Biomolecular, and Pharmaceutical Chemistry (Council of Physical Sciences) | 10 % |
|
| Panel |
Chemistry 2 |
| Department or equivalent |
Institute of Biochemistry (HUN-REN Biological Research Centre Szeged) |
| Participants |
Borics, Attila
Dvorácskó, Szabolcs
Fehér, Tamás
Fiser, Gabriella
Hunyadi-Gulyás, Éva Csilla
Kele, Zoltán
Kertész, István
Ködmön, Ádám
Körmöndiné Buzás, Krisztina
Kóta, Zoltán
Trencsényi, György
Vizler, Csaba
Zabos, Richárd
|
| Starting date |
2017-09-01 |
| Closing date |
2022-08-31 |
| Funding (in million HUF) |
47.846 |
| FTE (full time equivalent) |
13.63 |
| state |
closed project |
Summary in Hungarian A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
A tervezett kutatás célja a GPI-horgonyzott fehérjék egy speciális tulajdonságának kihasználása alapkutatási és farmakológiai célokra. Izolált GPI-horonyzott fehérjék ugyanis spontán beépülnek a sejtmembránba és biológiai funkciójukat megtartják. Ebből kiindulva célunk olyan koleszterin származékok előállítása, amelyek a GPI glikolipidek membrán horgony funkcióját utánozva lehetővé teszik konjugált fehérjék ex vivo sejtmembránba juttatását. A fehérjék széles körére alkalmazható kemoszelektív eljárás kidolgozásához bioortogonális funkciós csoportokat építünk fehérjék C- vagy N-terminális végébe, valamint fluoreszcens koleszterin származékokba. A megfelelő fehérje és koleszterin származékok konjugációs reakcióinak összehasonlító vizsgálatát követően tanulmányozzuk a koleszteril-lipoproteinek ciklodextrin zárványkomplexeinek kialakulását és exoszómákkal történő asszociációját, majd ezen vivőrendszerek segítségével optimalizáljuk a koleszteril-lipoproteinek sejtmembránba juttatását. Az alkalmazási lehetőségek bővítése érdekében az amfifil koleszterin származékokba különböző spektrális tulajdonságokkal rendelkező fluorofórokat, a horgonyzott fehérje kontrollált felszabadítását lehetővé tevő proteolitikus felismerő szekvenciát, illetve F-18 vagy Ga-68 izotópos jelölésre alkalmas funkciót építünk. A kidologozott fehérje beviteli módszert az interleukin-15 immunsejtek membránjába juttatására alkalmazzuk és in vitro vizsgálatokkal ellenőrízzük a koleszteril IL-15 bioaktivitását. A lipid kettősréteghez horgonyzás fehérje szerkezetre gyakorolt hatásait CD és NMR spektroszkópia segítségével, a vivőrendszer in vivo alkalmazhatóságát pedig PET képalkotás segítségével vizsgáljuk.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
Félszintetikus lipoproteinek kísérleti és farmakológiai célú alkalmazását korlátozza, hogy szintetikus lipiddel történt módosítást követően a fehérjék lipoprotein származékai vegyes micelláris lipid asszociátumokat képeznek. Így egyrészt a lipid fejcsoport fluoreszcens jelölését nem lehet a hozzákapcsolt fehérje nyomon követésére alkalmazni, másrészt élő sejtes felhasználáskor a lipoprotein vegyes micelláris asszociátumaival kezelt sejtek membránjába nagy mennyiségű lipid molekula is beépül, és erre a környezeti stresszre adott sejtválasz módosíthaja a sejtfelszínre juttatott fehérje hatását. A tervezett kísérletek során olyan koleszteril lipoproteinek és vivőrendszereik előállítását valósítjuk meg, amelyekkel ezen problémák kiküszöbölhetők. Az eddigi eredményeink alapján tervezett kísérletek azon a hipotézisen alapulnak, hogy (i) koleszteril-lipoproteinek előállíthatók detergens- és micelláris eredetű lipidfelesleg mentes formában, (ii) koleszterin származékok a sejtmembrán lipid raft régióiba képesek horgonyozni a kovalensen kapcsolt fehérjét, (iii) exogén lipoproteinek sejtmembránba juttatását követően a membrán-asszociált fehérjék megtartják eredeti funkciójukat, valamint (iv) ciklodextrinek vagy exoszómák alkalmazhatók koleszteril lipoproteinek célzott sejtmembránba juttatására. Az általános módszerfejlesztésen túl az interleukin-15 membránasszociált származékának előállítása, majd részletes in vitro funkcionális és szerkezeti vizsgálata választ ad arra, hogy milyen szerkezeti következményekkel jár egy citokin sejtmembránhoz horgonyzása, illetve összetett biológiai hatása hogyan módosítható ezzel a stratégiával.
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
A kidolgozásra kerülő konvergens szintézis stratégia egyszerűen általánosítható membrán-asszociált fehérjék tanulmányozására, mivel tetszőleges rekombináns vagy szintetikus fehérje koleszteril-származékának előállítására alkalmas. Sőt a membránhorgony molekula fejcsoportjának linker molekularésze és az ott található fluorofór is a célfehérje vizsgálatához szükséges kísérleti elrendezésnek megfelelően módosítható. A módszer előnye, hogy a sejtmembránhoz horgonyzott fehérjék fluoreszcens jelölését a koleszterin molekularészhez kapcsolt kis méretű fluorofórral oldja meg, vagyis az élősejtes kísérletek során nem kell a fluoreszcens fehérjefúzió fehérje-fehérje kölcsönhatást módosító sztérikus hatásaival számolni. Ezáltal nemcsak membrán-asszociált fehérjék sejten belüli körforgásának fluoreszcencia mikroszkópiás tanulmányozásához alkalmas módszerhez jutunk, hanem N-15 és C-13 jelzett fehérjék segítségével a membrán kettősréteghez horgonyzott fehérjék NMR szerkezetvizsgálata is lehetővé válik. A módszer további általános felhasználási lehetősége a rekombináns helyspecifikus módosítást tartalmazó fehérjék koleszterin származékainak előállítása. Mivel a kutatási tervben bemutatott bioortogonális funkciós csoportok genetikai kódolása megoldott, így már meglévő konstrukciók esetén ugyanezen konjugációs eljárások alkalmazhatók. Újszerű alkalmazásra nyithatnak lehetőséget a koleszteril-lipoproteinek ciklodextrin komplexei, ugyanis számos GPI-horgonyzott fehérjéről kimutatták, hogy képesek sejtről sejtre diffundálni. A fiziológiai jelentősége még nem ismert ennek az intercelluláris membránfehérje cserének, ugyanakkor a kidolgozásra kerülő módszer segítségével olyan, lipidfelesleget nem tartalmazó fluoreszcens lipoproteinek állíthatók elő, amelyekkel tanulmányozható ez a jelenség. A GPI-horgonyzott fehérje mimetikumok alkalmasak lehetnek terápiás felhasználásra is GPI-horgonyzott fehérjékkel kapcsolatos kórképek esetében. Az interleukinek exoszómákhoz kapcsolásával farmakológiailag értékes származékokat nyerhetünk, ugyanis ezzel a vivőrendszer stratégiával célzottan juttathatunk daganatos sejtekbe sejtfelszíni fehérjéket és így a terápiás citokinek számos mellékhatását csökkenthetjük.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
Fehérjék specifikus módosítása és irányított célba juttatása óriási jelentőségű mind in vitro és in vivo vizsgálatokban, mind pedig terápiás célú alkalmazáskor. Fluoreszcens jelek segítségével térbeli eloszlásuk és mennyiségük határozható meg, lipidálást követően pedig egy megfelelő vivőrendszer alkalmazásával a befolyásolni kívánt sejtcsoportba juttatásuk valósítható meg. Célunk olyan koleszterin származékok előállítása, amelyek fizikai-kémiai tulajdonságaiknál fogva alkalmasak arra, hogy fehérjéket élő sejtek felszínére juttassanak, illetve fehérje konjugátumaik élő sejten belüli helyzete fluoreszcencia mikroszkópiás módszerek segítségével láthatóvá tehető. Ahhoz, hogy egy fehérjemolekulát a kovalensen hozzá kapcsolt koleszterin származék fluoreszcenciája alapján azonosíthassunk, illetve nyomon követhessünk, alapvetően azt kell megoldani, hogy a vizes oldatban micellákat alkotó amfifil koleszterin származékok ne asszociálódjanak a koleszteril-lipoproteinhez. Eközben a fehérje natív térszerkezetét is meg kell őrízni, hogy biológiailag releváns szerkezeti és funkcionális információkhoz jussunk. Az erre alkalmas kísérleti körülmények kidolgozását követően a kapott koleszteril-lipoproteinek sejtmembránba juttatását optimalizáljuk és egy interleukin farmakológiai tulajdonságainak javítására alkalmazzuk. Így egy olyan, a daganat terápiában is alkalmazható fehérje hatóanyag formát kaphatunk, amely kedvezőbb mellékhatás profilt mutat. A tervezett horgony molekulákba olyan csoportot is beépítünk, amely radioaktív jelölést követően lehetővé teszi a koleszterin származékok és fehérje konjugátumaik élő szervezeten belüli eloszlásának PET képalkotásos megjelenítését.
| Summary Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
The objective of the proposal is to exploit a special feature of GPI-anchored proteins for basic research and pharmacological purposes. It is based on that isolated GPI-APs can be reinserted into the plasma membrane of recipient cells with the retention of the biological function. To mimic the membrane anchoring function of GPI glycolipids with simplified molecules and to obtain ex vivo protein transfer agents, novel cholesterol derivatives will be prepared and conjugated to proteins. The specific modification of synthetic or recombinant proteins requires conjugation chemistries not interfering with the amino acid side chain functional groups that will be achieved by the introduction of bioorthogonal functions into the protein and into the cholesterol anchor. A comparative study of these conjugations will result in an optimized method for the preparation of homogenous lipoproteins. For widening the scope of the applications, the headgroup of the cholesterol anchor will be diversified by incorporating various fluorophores, proteolytic recognition sequences or precursor functions for the introduction of F-18 or Ga-68 radionuclides. The cyclodextrin inclusion complexes of the cholesteryl lipoproteins and their exosome associates will be investigated as protein transfer vectors, and the usefulness of the procedure will be demonstrated by the delivery of cholesteryl interleukin-15 into the plasma membrane of immune cells. The functional and structural effects of the membrane anchoring of this cytokine will be explored by in vitro experiments, and CD and NMR studies, respectively, while the in vivo applicability of the delivery system will be evaluated by PET imaging.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
The wide-spread application of semisynthetic lipoproteins in basic research and pharmacological studies of membrane-associated proteins is restricted, because the in vitro protein lipidation results in mixed micelles of the lipoprotein and surplus lipids. Therefore the reporter tags of the lipid headgroup cannot be used for the detection of the attached protein. Further, significant amount of surplus lipids are introduced into the cell membrane when the mixed micelles of the lipoprotein is used to treat cells. This stress may trigger responses that can modify the normal biological function of the exogenously introduced protein. In order to avoid these drawbacks, cholesteryl lipoproteins and appropriate delivery systems are designed and will be developed. Based on our preliminary results the hypothesis behind the research plan is that (i) semisynthetic cholesteryl lipoproteins containing a fluorescent reporter can be prepared in a lipid excess- and detergent-free form, (ii) the cholesterol derivatives can anchor the attached protein into the lipid raft regions of the cell membrane, (iii) the membrane-associated proteins exogenously introduced to the cell membrane will reserve the function of the protein, and (iv) cyclodextrines or exosomes can be loaded with cholesteryl lipoproteins and they can be applied as vectors for targeted delivery of the membrane-associated protein. Beyond a general method development, a membrane-bound interleukin-15 will be prepared and its detailed functional and structural investigation will reveal how the cell membrane association affects the structure of the cytokine and how the complex biological activity can be modified by this strategy.
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
The designed convergent strategy for the preparation of cholesteryl lipoproteins can be generalized for wide-spread applications in the study of membrane-associated proteins. The bioorthogonal protein conjugation of the cholesteryl anchors does not interfere with the natural amino acid side-chains of the target proteins, and both the linker moiety and the fluorophore of the cholesterol anchor headgroup can flexibly be modified according to the experimental setup. One of the main advantages of the suggested method is that small molecule fluorophores are used for the labelling of the membrane-anchored protein, thus, the perturbation of the protein-protein interactions and protein function by the steric effects of the fluorescent protein fusion can be excluded in live cell experiments. As a result, special tools will be obtained for the fluorescent microscopic investigation of the cellular traffic of membrane proteins, and for the NMR structural studies of membrane anchored proteins after N-15 and/or C-13 labelling. Another important application is the preparation of cholesteryl derivatives of proteins containing site-specific bioorthogonal modifications. In these cases the proposed conjugation chemistry can be adopted for existing protein constructs. A novel application of the cyclodextrin inclusion complexes of the cholesteryl lipoproteins is in the investigation of the spontaneous intercellular transfer of the GPI-anchored proteins. The physiological significance of this process is rather unknown, however, with the help of our method, a homogenous population of lipid-excess-free cholesteryl lipoproteins will be available for studying the kinetics of the process. Furthermore, the GPI-anchored protein mimetics raises the possibility of developing cholesteryl lipoproteins suitable for therapeutic use, and the surface engineering of stem cells, dendritic cells and enveloped viruses can also be achieved. Preparation of exosomes loaded with cholesteryl interleukins results in nanoparticles with great pharmacological value, because they are appropriate for targeted cell delivery of cell surface proteins, and this way the side-effects of therapeutic cytokines can be decreased.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
Specific modification and targeted delivery of proteins are highly important for in vitro and in vivo experiments and also for therapeutic applications. The spatial arrangement of the fluorescent labelled proteins and their local concentration can be determined by measuring their fluorescence, while after lipidation they can be transferred to target cells using an appropriate delivery system. Our aim is the preparation of cholesterol derivatives that are appropriate for live cell surface anchoring of proteins and also for visualization of the cellular traffic of their protein conjugates. In order to assign the fluorescence of the lipid anchor to the attached protein, it is crucial to avoid the formation of mixed micellar associates consisting of the lipoprotein and lipid excess. Furthermore, the disruption of these micellar associates should be performed in a way that the native fold of the attached protein remains intact, otherwise the biological relevance of the structural and functional information is doubtful. After optimizing the cell membrane delivery of the semisynthetic cholesteryl lipoproteins, it will be applied to improve the pharmacological profile of an interleukin via membrane anchoring and using exosomes as delivery vectors. This way an advantageous form of a biologically active protein will presumably be obtained with a more appropriate pharmacological profile for cancer therapy. In order to image the cholesterol anchor or its protein conjugate within living animals by PET, a specific function will also be introduced to the anchor molecule that is appropriate for F-18 or Ga-68 labelling.
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
List of publications |
|
|
| Szűcs Edina, Marton János, Szabó Zoltán, Hosztafi Sándor, Kékesi Gabriella, Tuboly Gábor, Bánki László, Horváth Gyöngyi, Szabó Pál T., Tömböly Csaba, Varga Katalin Zsuzsanna, Benyhe Sándor, Ötvös Ferenc: Synthesis, biochemical, pharmacological characterization and in silico profile modelling of highly potent opioid orvinol and thevinol derivatives, EUROPEAN JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY 191: 112145, 2020 | | Szabó Írisz, Varga Viktória É., Dvorácskó Szabolcs, Farkas Attila E., Körmöczi Tímea, Berkecz Róbert, Kecskés Szilvia, Menyhárt Ákos, Frank Rita, Hantosi Dóra, Cozzi Nicholas V., Frecska Ede, Tömböly Csaba, Krizbai István A., Bari Ferenc, Farkas Eszter: N,N-Dimethyltryptamine attenuates spreading depolarization and restrains neurodegeneration by sigma-1 receptor activation in the ischemic rat brain, NEUROPHARMACOLOGY 192: 108612, 2021 | | Hus-Citharel Annette, Bouby Nadine, Corbani Maithe, Mion Julie, Mendre Christiane, Darusi Judit, Tomboly Csaba, Trueba Miguel, Serradeil-Le Gal Claudine, Llorens-Cortes Catherine, Guillon Gilles: Characterization of a functional V-1B vasopressin receptor in the male rat kidne evidence for cross talk between V-1B and V-2 receptor signaling pathways, AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY: RENAL PHYSIOLOGY 321: (3) pp. F305-F321., 2021 | | Almási Nikoletta, Török Szilvia, Dvorácskó Szabolcs, Tömböly Csaba, Csonka Ákos, Baráth Zoltán, Murlasits Zsolt, Valkusz Zsuzsanna, Pósa Anikó, Varga Csaba, Kupai Krisztina: Lessons on the Sigma-1 Receptor in TNBS-Induced Rat Colitis, INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES 21: (11) 4046, 2020 | | Zádor Ferenc, Nagy-Grócz Gábor, Dvorácskó Szabolcs, Bohár Zsuzsanna, Cseh Edina Katalin, Zádori Dénes, Párdutz Árpád, Szűcs Edina, Tömböly Csaba, Borsodi Anna, Benyhe Sándor, Vécsei László: Long-term systemic administration of kynurenic acid brain region specifically elevates the abundance of functional CB1 receptors in rats., NEUROCHEMISTRY INTERNATIONAL 138: 104752, 2020 | | Zádor Ferenc, Nagy-Grócz Gábor, Kekesi Gabriella, Dvorácskó Szabolcs, Szűcs Edina, Tömböly Csaba, Horvath Gyongyi, Benyhe Sándor, Vécsei László: Kynurenines and the Endocannabinoid System in Schizophrenia, MOLECULES 24: (20) 3709, 2019 | | Dimmito null, Stefanucci null, Pieretti null, Minosi null, Dvorácskó Szabolcs, Tömböly Csaba, Zengin null, Mollica null: Discovery of Orexant and Anorexant Agents with Indazole Scaffold Endowed with Peripheral Antiedema Activity, BIOMOLECULES 9: (9) 492, 2019 | | Bacsa Ildikó, Herman Bianka Edina, Jójárt Rebeka, Herman Kevin Stefan, Wölfling János, Schneider Gyula, Varga Mónika, Tömböly C, Rizner Tea Lanisnik, Szécsi Mihály, Mernyák Erzsébet: Synthesis and structure–activity relationships of 2- and/or 4-halogenated 13β- and 13α-estrone derivatives as enzyme inhibitors of estrogen biosynthesis, JOURNAL OF ENZYME INHIBITION AND MEDICINAL CHEMISTRY 33: (1) pp. 1271-1282., 2018 | | Corbani M, Marir R, Trueba M, Chafai M, Vincent A, Borie AM, Desarmenien MG, Ueta Y, Tomboly C, Olma A, Manning M, Guillon G: Neuroanatomical distribution and function of the vasopressin V-1B receptor in the rat brain deciphered using specific fluorescent ligands, GEN COMP ENDOCR 258: pp. 15-32., 2018 | | De Prins A, Martin C, Van Wanseele Y, Skov LJ, Tomboly C, Tourwe D, Caveliers V, Van Eeckhaut A, Holst B, Rosenkilde MM, Smolders I, Ballet S: Development of potent and proteolytically stable human neuromedin U receptor agonists, EUR J MED CHEM 144: pp. 887-897., 2018 | | De Prins A, Martin C, Van Wanseele Y, Tomboly C, Tourwe D, Caveliers V, Holst B, Van Eeckhaut A, Rosenkilde MM, Smolders I, Ballet S: Synthesis and in Vitro Evaluation of Stabilized and Selective Neuromedin U-1 Receptor Agonists, ACS MED CHEM LETT 9: (5) pp. 496-501., 2018 | | Recinella L, Chiavaroli A, Ferrante C, Mollica A, Macedonio G, Stefanucci A, Dimmito MP, Dvoracsko S, Tomboly C, Brunetti L, Orlando G, Leone S: Effects of central RVD-hemopressin(alpha) administration on anxiety, feeding behavior and hypothalamic neuromodulators in the rat, PHARMACOL REP 70: (4) pp. 650-657., 2018 | | Stefanucci A, Novellino E, Macedonio G, Dimmito MP, Mirzaie S, Cardoso FC, Lewis R, Zador F, Erdei AI, Dvoracsko S, Tomboly C, Benyhe S, Pieretti S, Minosi P, Mollica A: Design, synthesis and biological profile of mixed opioid agonist/N-VGCC blocker peptides, NEW J CHEM 42: (8) pp. 5656-5659., 2018 | | Dvorácskó S., Keresztes A., Mollica A., Stefanucci A., Macedonio G., Pieretti S., Zádor F., Walter F.R., Deli M.A., Kékesi G., Bánki L., Tuboly G., Horváth G., Tömböly C.: Preparation of bivalent agonists for targeting the mu opioid and cannabinoid receptors, EUROPEAN JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY 178: pp. 571-588., 2019 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
