 |
In vivo assessment of the NPHS2 interallelic interactions
|
Help 
Print 
|
Here you can view and search the projects funded by NKFI since 2004
Back »
|
| |
Details of project |
|
|
| Identifier |
125566 |
| Type |
KH |
| Principal investigator |
Tory, Kálmán |
| Title in Hungarian |
Az NPHS2 interallelikus interakcióinak vizsgálata in vivo |
| Title in English |
In vivo assessment of the NPHS2 interallelic interactions |
| Keywords in Hungarian |
interallelikus interakciók, recesszív nephrosis, podocin |
| Keywords in English |
interallelic interactions, recessive nephrotic syndrome, podocin |
| Discipline |
| Biological basis of diseases related to the above (Council of Medical and Biological Sciences) | 40 % | | Molecular genetics, reverse genetics and RNAi (Council of Medical and Biological Sciences) | 35 % | | Ortelius classification: Molecular genetics | | Genetic epidemiology (Council of Medical and Biological Sciences) | 25 % |
|
| Panel |
Physiology, Pathophysiology, Pharmacology and Endocrinology |
| Department or equivalent |
1st Dept. of Pediatrics (Semmelweis University) |
| Participants |
Keszthelyi, Tália Magdolna
Regös, Ágnes
|
| Starting date |
2017-09-01 |
| Closing date |
2019-08-31 |
| Funding (in million HUF) |
19.968 |
| FTE (full time equivalent) |
2.60 |
| state |
closed project |
Summary in Hungarian A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
A gyermekkori szteroid-rezisztens nephrosis (SRNS) harmadáért monogénes podocytopathiák felelősek. Ezen betegségek közel felét a podocint kódoló NPHS2 gén mutációi okozzák. Korábban kimutattuk, hogy a leggyakoribb NPHS2 variánsnak (R229Q, MAF: 3,8% Európában) a patogenitása kizárólag a transz-asszociált mutáció függvénye: csak specifikus mutációkhoz társulva patogén. Epidemiológiai megközelítésünk azonban csak a gyakori mutációk esetén volt informatív: mindössze kilenc társulásról tudjuk, hogy patogén. Jelen munka célja, hogy beállítsunk egy módszert a ritka R229Q társulások patogenitásának megítélésére, illetve, hogy az NPHS2 génben talált más kérdéses patogenitású variáns-asszociációk esetén megítéljük az interallelikus interakció szerepét.
In vivo vizsgálattal szeretnénk mindezt megválaszolni. Ehhez az NPHS2 ortológjára, a mec-2 génre mutáns, finomérintés-érzékelésében károsodott Caenorhabditis elegans törzsön készülünk vizsgálni a humán podocin mentesítő hatását. A C. elegans MEC-2 és a humán podocin 85,3 %-ban homológ, melynél lényegesen alacsonyabb homológia esetén is ismert humán ortológok mentesítő hatása (BCL2 és CED-9 valamint E2A és HLH-2 ortológ párok esetén). A vad podocinnal történő mentesítés igazolását, mértékének meghatározását követően, ugyanazon vektor által kódolt, különböző módon jelölt podocin-párokat fogunk kifejeztetni, összetett heterozigóta állapotot modellezve. Először az ismert hatású podocin-párok mentesítő hatását vizsgáljuk, majd az ismeretlenekét. Utóbbiak patogenitását a mentesítés léte vagy hiánya alapján fogjuk eldönteni. A nematodán végzett vizsgálatok a humán podocin interakcióinak funkcionális és gyors vizsgálatát teszik lehetővé.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
Az NPHS2 gén R229Q variánsa az első olyan variáns a humán genetikában, melynek patogenitása kizárólag a transz-asszociált mutáció függvénye. A jelenség felismerése újabb kérdéseket szül: mely mutációkhoz társultan patogén, milyen mechanizmus révén patogének ezen társulások, és létezik-e más podocin variáns, melynek patogenitása interallelikus interakció függvénye. Eddigi eredményeink alapján a patogén [mutáció];[R229Q] társulások a C-terminális dimerizációt befolyásolják úgy, hogy az a podocin intracelluláris lokalizációját módosítja, membrán-elhelyezkedését gátolja. Ismereteink azonban kizárólag a biztosan megítélhető kilenc gyakori társuláson alapulnak, a ritka társulásokról nem tudjuk megbízhatóan eldönteni, hogy patogének-e. A podocin interakcióinak sejtszintű vizsgálata során megfigyeltünk komplementációra utaló jelenséget is, mely alapján felmerül, hogy bizonyos patogén mutációk egymás hatását komplementálni tudják. Olyan interakciók azonosítása tehát a kutatásunk alapkérdése, melyek a patogenitást megváltoztatják. Azonosításuk meghatározó a patomechanizmus, a dimerizáció és a lokalizáció kapcsolatának megértésében, melynek végső célja, hogy a kóros dimerizációt terápiásan befolyásolni tudjuk. Újabb eredményeink alapján ugyanis a dimerizáció nem szükséges a membrán-lokalizációhoz, így a patogén dimerizáció gátlása terápiás lehet a patogén [mutáció];[R229Q] társulást hordozó betegekben. A jövőben a dimerizációt gátló szer fejleszthető a patogén társulások ismeretében, illetve a patogén társulást expresszáló nematodákon potenciálisan terápiás szerek hatása tesztelhető.
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
Az NPHS2-asszociált nephrosis a gyermekkori szteroid-rezisztens nephrosis leggyakoribb monogénes oka, az összes eset 12-18%-áért felelős. Kezelése nem ismert, minden érintett művese-kezelésre vagy transzplantációra szorul. A patomechanizmus megértése megkerülhetetlen lépés az oki terápia bevezetéséhez.
A szteroid-rezisztens nephrosis immunológiai és monogénes formájának elkülönítése döntő az immunszuppresszió alkalmazásában, de az esetek jelentős részében csak genetikai vizsgálattal lehetséges. A patogén és nem patogén [mutáció];[R229Q]-társulások elkülönítése ezért a klinikai gyakorlatban visszatérő nehézség: francia, német és angol centrumokból kaptunk ezidáig megkeresést, illetve jelenleg egy, a hazai centrumban gondozott gyermek esetében merül fel ez a kérdés. Vizsgálatunk eredménye tehát közvetlen klinikai jelentőséggel bír.
Az R229Q átlagpopulációs gyakorisága (Európában minden 15. ember hordozza) miatt a genetikai tanácsadás számára is fontos, hogy mely NPHS2 mutációt hordozó családtagok esetében érdemes a házastársat szűrni az R229Q variánsra.
Budapest a podocin-kutatás egyik fellegvárává kezd kinőni: a kutatócsoportunk által beállított humán sejtes podocin-expresszió és fehérje-kivonás, az MTA-ELTE Fehérjemodellező Kutatócsoport által végzett bakteriális expresszió és szerkezet-kutatás, a SE Biofizikai Intézetében beállított FRET-alapú interakció-mérés teszik ezt lehetővé. Az interakciók in vivo vizsgálatának bevezetése teheti fel erre a koronát. A kutatócsoportban egy C. elegans kutatásban tíz éves tapasztalattal bíró biológus és egy podocin-kutatásban nyolc éves tapasztalattal bíró, az első interakciót felismerő gyermekgyógyász-genetikus dolgozik együtt.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
Az autoszomális recesszív betegségek kialakulásához mindkét szülői génváltozaton szükséges egy-egy mutáció jelenléte. A közelmúltban azonosítottuk a humán genetikában az első olyan variánst, melynek kóroki szerepe kizárólag a társuló mutációtól függ: csak akkor okoz betegséget, ha a másik szülői génváltozaton meghatározott mutációkhoz társul. Az azonosított variáns által okozott betegség hosszú távon veseelégtelenséghez vezet, mely transzplantációt tesz szükségessé. Ezen betegségnek immunológiai eredete is lehetséges, mely az immunrendszert hosszú időn át gyengítő terápiával kezelhető. Miután utóbbi kezelésnek számos mellékhatása van, fontos, hogy el tudjuk különíteni a betegség genetikai és immunológiai formáját. Szükségessé teszi ez annak eldöntését is, hogy ezen gyakori variáns milyen típusú asszociációját azonosítottuk egy betegben: kórokit vagy nem kórokit. A kutatócsoportot több külföldi központból keresték meg ezen kérdéssel egy-egy beteg kapcsán. A ritka társulások kóroki szerepe megbízhatóan csak állatmodell révén ítélhető meg. A mutáció-társulások vizsgálata magasabb rendű állatokban rendkívül költséges és időigényes. Egy féregmodellt választottunk ezért, melyben ezen fehérje károsodása finomérintés-zavart okoz, így könnyen vizsgálható. A féreg- és a humán fehérje igen hasonló ahhoz, hogy a féreg-fehérjét a humán fehérjével helyettesítsük, és így közvetlenül a humán mutáció-párok hatását vizsgálhassuk féreg modellen. Kezdetben a módszert validáljuk az epidemiológiai alapon már ismert hatású, betegséget okozó és nem okozó mutáció-párok hatásának vizsgálatával, ezt követi az ismeretlen hatású párok vizsgálata. Vizsgálataink végső célja a kórfolyamat megértése.
| Summary Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
Monogenic podocytopathies are responsible for one third of childhood steroid-resistant nephrotic syndrome cases. Almost half of the monogenic podocytopathies are caused by NPHS2 mutations that encodes podocin, a component of the slit diaphragm. We formerly showed that the pathogenicity of the most frequent NPHS2 R229Q variant (MAF: 3,8% in Europe) depends on the trans-associated mutations: it is only pathogenic when associated to specific 3’ mutations. Our epidemiologic approach was only informative in the assessment of the frequent associations: only nine associations are known to be pathogenic. The aim of the present project is to establish an in vivo model that allows to distinguish pathogenic and non-pathogenic R229Q-associations, and to identify other interallelic interactions in NPHS2.
For this purpose, we are going to use an in vivo model, a mec-2 mutant Caenorhabditis elegans strain. MEC-2, the orthologue of podocin, is required for gentle touch sensation. MEC-2 and human podocin are highly homologous (85,3%) allowing us to expect that the expression of human podocin will rescue the phenotype of the mec-2 mutant strain (such a rescue has already been described in orthologs with a lower homology: BCL2 and CED-9 or E2A and HLH-2). Once a rescue is obtained, differently tagged podocin variants will be coexpressed two by two, mimicking a compound heterozygous state. Associations with a known pathogenicity will be first examined, followed by the unknown ones. The pathogenicity of the latter’s will be determined on the basis of their rescue effect on the mechanosensation: providing a fast and functional assay of podocin interactions.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
The NPHS2 R229Q variant is the first variant in human genetics, the pathogenicity of which depends on the trans-associated mutation. The recognition of this phenomenon raises new questions: which mutations are pathogenic with R229Q, what is the mechanism of the pathogenic interactions and if there are other interallelic interactions in NPHS2. Based on our previous results, the pathogenic [mutation];[R229Q] associations alter the C-terminal dimerization resulting in the abnormal subcellular localization of podocin. The pathogenicity of the associations has thus far been assessed by an epidemiological approach, allowing the identification of only nine frequent pathogenic associations. We still cannot assess the pathogenicity of the rare ones. Furthermore, in cell culture experiments we also observed the complementary effect of some podocin mutants on the localization of others raising the possibility of an opposite interaction: interallelic complementation.
Our aim is to identify interallelic interactions in NPHS2, which alter the pathogenicity of the NPHS2 variants. Their identification is essential in the understanding of the pathomechanism: the relationship between the dimerization and the localization. This is expected to lead us to the final aim, the therapeutic blockade of the pathogenic dimerization. This may be promising as according to our most recent results, the dimerization of podocin is not necessary for its membranous localization and for at least a partial function. Thus, blockade of the dimerization in patients with pathogenic [mutation];[R229Q] associations may be therapeutic. Therapeutic agents can be eventually screened in the nematode model later.
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
NPHS2-associated nephrotic syndrome is the most frequent cause of childhood steroid-resistant nephrotic syndrome (SRNS) being responsible for its 12-18%. No curative therapy is available, all patients progress to renal failure necessitating renal replacement therapy. Understanding its pathomechanism is therefore essential.
As the immunological forms of SRNS can be treated by immunosuppression, it is essential to distinguish them from the monogenic forms, which relies on the results of genetic tests. Therefore, distinction of the pathogenic and non-pathogenic [mutation];[R229Q] associations is crucial in the clinical practice. French, German and British nephrology centers contacted us with this question, and this question is also raising in case of a Hungarian child. This project may therefore directly help the clinical care.
Furthermore, the high allele frequency of R229Q (1/15 individuals is a carrier in Europe) makes important for the genetic counseling to know which mutation carriers are at risk of having affected children if their spouse is an R229Q carrier.
Budapest is an emerging center of podocin research. The podocin expression and extraction performed by our laboratory, its bacterial expression and structural modelling in the MTA-ELTE Protein Model. Res. Group, the FRET analysis of podocin dimers by the Department of Biophysics (Semmelweis U) make this possible. The in vivo model of this project would top off this research. A biologist with ten years of experience in C. elegans research and a pediatrician-geneticist with eight years of experience in podocin research and the initiator of the Hungarian cooperation, work together on this project.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
In autosomal recessive disorders both parental gene copies need to be mutated. We recently identified the first variant (R229Q) that is only disease-causing when associated to some specific mutations on the other parental gene copy. This is a frequent variant; 1 in 15 individuals carries it in the general European population. When pathogenic, it causes a severe kidney disorder necessitating dialysis or renal transplantation. Other forms of this kidney disorder have an immunological origin and thus are treatable. However, to properly indicate the immunosuppressive therapy, it is essential to distinguish immunological and genetic forms of the disease. For this reason, and also to understand the pathogenicity of some associations, it is essential to distinguish pathogenic and non-pathogenic associations of R229Q. We have been contacted by several European nephrology centers with this question. Nevertheless, disease-causing capacity of the rare associations can only be assessed by an animal model. Higher animal models are expensive and time-consuming. We aim to establish a worm model that is mutated for the corresponding gene and is affected in its gentle touch sensation. We will introduce the highly similar human protein and study its rescue effect on the gentle touch sensation. Similar rescue effects of human proteins in mutated worms have already been observed in case of proteins with a much lower similarity. After confirming that the worm model can properly assess the disease causing capacity of the known associations, we are going to study the unknown ones. This can greatly help us both in the clinical practice and in the understanding of the pathomechanism.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
