Molecular biology (Council of Medical and Biological Sciences)
100 %
Ortelius classification: Molecular biology
Panel
European Reserach Council (ERC)
Department or equivalent
Dept. of Biophysics and Radiation Biology (Semmelweis University)
Starting date
2017-09-01
Closing date
2017-11-30
Funding (in million HUF)
3.042
FTE (full time equivalent)
0.25
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. A szerin/treonin kináz RAF1, melyet eredetileg a MEK/ERK modul aktivátoraként azonosítottak kölcsönhatást alakít ki a citoszkeletont szabályozó kinázzal, a ROKα-val. A RAF1/ROKα komplex nélkülözhetetlen a fibroblasztok, keratinociták és endotél sejtek vándorlásához, továbbá a RAS-vezérelt epidermális tumorok fenntartásához. Mivel endotél sejtekben a RAF1 felelős a ROKα megfelelő sejtkapcsolati lokalizációjáért, hozzájárulva a sejtek kollektív migrációjához szükséges kohéziós erőkhöz, ezért az endotél sejtek mechanikai válaszát tanulmányozva analizálhatjuk a komplex komponenseinek szerepét a sejtkapcsolat dinamikájában. Továbbá, BRAF erősíti a sejtkapcsolatokat, ugyanakkor aktivitása fontos a tumorok erei áteresztő képességének szabályozásában. Az e mögötti molekuláris mechanizmus felderítése hozzájárul a sejtkapcsolatok dinamikája és az erek permeabilitása közötti kapcsolat megértéséhez.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. A MEK/ERK modul aktivátor RAF1 és a citoszkeletont szabályozó kináz ROKα kölcsönhatása esszenciális az endotél sejtek kapilláris érképzésében. A RAF1 a sejtek közötti VE-Cadherin alapú kapcsolatok stabilitásához szükséges. A másik MEK/ERK modult aktiváló fehérje, a BRAF ellentétes hatással bír, ugyanis a BRAF távollétében megerősödnek a sejtkapcsolatok. Tehát, mind a RAF1, mind a BRAF (RAF1-en keresztül) szerepet játszik a ROKα sejtkapcsolati lokalizációjában és aktivitásában. Ahhoz, hogy megértsük, hogyan járul hozzá a RAF1/ROKα jelátviteli komplex a sejtkapcsolati dinamikához, az endotél sejtek mechanikai válaszát fogjuk analizálni. Ezzel a módszerrel BRAF és RAF1 jelen- illetve távollétében meg fogjuk vizsgálni hogyan hat az alkalmazott erő a ROKα és szubsztrátja, a miozin könnyű lánc lokalizációjára, azzal a céllal, hogy megértsük a mechanika és a jelátvitel közötti kapcsolatot.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! A sejtek közötti kapcsolatok központi szerepet töltenek be a sejt-sejt kohézióban és a kollektív sejtvándorlásban. Az utóbbi jelenség esszenciális a metasztázis kialakulásában és a tumorok beereződésében. E folyamatokhoz a sejtek közötti kapcsolatok dinamikájának precíz kontrollja szükséges, mely a sejtkapcsolatokkal összeköttetésben lévő akto-miozin hálózaton keresztül valósul meg. Az aktin-citoszkeletont szabályozó kináz, a ROKα hatását a miozin könnyű láncának (MLC) foszforilációján keresztül fejti ki. A foszforilált MLC által generált erő nagysága határozza meg a sejtek közötti kohéziós erő mértékét. Érdekes módon a MEK/ERK modult aktiváló kinázok, RAF1 és BRAF befolyásolják a ROKα mennyiségét és aktivitását a sejt-kapcsolatoknál. Tehát ezek a kinázok fontos szerepet játszanak a sejt-sejt kohézióban és a sejtkapcsolatok finomhangolásában. Mechanikai erőket alkalmazva az endotél sejteken megvizsgáljuk, hogyan hat a ROKα lokalizációjára és aktivitására és a sejt-kapcsolatok dinamikájára. Ez a tudás hozzásegít annak megértéséhez hogyan járulnak hozzá ezek a fehérjék a kollektív sejtmozgáshoz szükséges kohéziós erők finom hangolásához.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. A kollektív sejtvándorlás fontos a tumor növekedéshez és a metasztázis képzéshez. E folyamatokhoz a sejt-sejt kohézió finomhangolása nélkülözhetetlen. A sejtek közötti kapcsolatok fontos szerepet töltenek be a sejt-sejt kohézió fenntartásában, melyet a sejt akto-miozin hálózata szabályoz. Ez a hálózat erőt generál az aktin-citoszkeletont szabályozó kináz, a ROKα aktiválásakor. A ROKα lokalizációját és aktivitását más, a RAF családba tartozó fehérje kinázok modulálják. Annak a megértése, hogy a RAF család hogyan szabályozza a ROKα erő-generálásban betöltött funkcióját hozzásegít a sejt-sejt kohézióban betöltött hozzájárulásuk megértéséhez. E kérdések megválaszolásához a kutatók endotél sejteken fogják vizsgálni, hogy hogyan befolyásolják a sejtekre ható erők a ROKα lokalizációját és aktivitását. Ez a megközelítés segít új stratégiákat találni a kollektív sejtmigrációhoz szükséges sejt-sejt kohézió megbontásához.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. The serine/threonine kinase RAF1, originally discovered as an activator of the MEK/ERK module, interacts with the cytoskeleton-regulating kinase, ROKα. The RAF1/ROKα complex is essential for the migration of fibroblasts, keratinocytes and endothelial cells as well as for the maintenance of the RAS-driven epidermal tumors. Since in endothelial cells RAF1 is necessary for the correct localization of ROKα to adherens junctions (AJs) and contributes to the intercellular cohesion forces required for collective migration, a mechanically induced feedback response of the endothelial cells can be used to analyze how the components of the complex contribute to AJ’s dynamics. In addition, BRAF strengthens the AJs and at the same time its activity is important for the modulation of blood vessel permeability of tumors. Understanding the underlying molecular mechanism would help to rationalize the connection between adherens junction dynamics and vessel permeability.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. The interaction of the MEK/ERK module activator RAF1 with the cytoskeleton-regulating kinase ROKα is essential for the sprouting angiogenesis of endothelial cells. RAF1 is necessary for the stabilization of VE-cadherin-based junctions between the cells. The other MEK/ERK module activator, BRAF has an opposite effect, since in the absence of BRAF the endothelial junctions are strengthened. Thus, both RAF1 and BRAF (through RAF1) have a role in fine tuning the amount and activity of ROKα at the junctions. In order to understand how the RAF1/ROKα signaling complex contributes to the junctional dynamics, we will subject the endothelial cell monolayer to mechanical stresses. Using this approach the impact of stress of different magnitudes and duration on the junctional localization of ROKα and its substrate, myosin light chain (MLC) both in the presence and in the absence of RAF1 and BRAF will be investigated to understand the interplay between mechanics and signaling.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. Adherens junctions (AJs) are central players controlling cell-cell cohesion and collective cell migration. The latter phenomenon is essential for the formation of metastatic lesions of tumor cells and tumor angiogenesis. The precise control of the junctional dynamics required for these processes is achieved through the connected actomyosin apparatus. The actin cytoskeleton-regulating kinase, ROKα exerts its role via phosphorylation of myosin light chain (MLC). Phosphorylated MLC generates contractile forces, which, depending on their strength and duration, determine the extent of cell-cell cohesion. Interestingly, the MEK/ERK module activating kinases, RAF1 and BRAF modulate the amount and activity of ROKα at the AJs. Thus, these kinases are important players in fine-tuning cell-cell cohesion and junctional dynamics. We will apply mechanical forces of different magnitudes and duration to monolayers of endothelial cells and examine how this affects localization and activity of ROKα at the adherens junction and how it contributes to junctional dynamics. This knowledge will provide insight into the role of these proteins in fine tuning cell-cell cohesion required for collective cell migration.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. Collective cell migration is crucial for tumor growth and metastasis formation. Fine tuning of cell-cell cohesion is essential for this process. Cell-cell junctions are important players in maintaining cell-cell cohesion and they are regulated by the actomyosin apparatus of the cells. This apparatus generates contractile forces upon activation by the actin cytoskeleton-regulating kinase, ROKα. The localization and activity of ROKα is modulated by other protein kinases of the RAF family. Understanding how the RAF family controls ROKα function in force generation would improve our knowledge of their contribution to cell-cell cohesion. In order to answer such questions, the researchers will use endothelial cell monolayers and investigate how the magnitude and duration of forces applied on the monolayer will influence the localization and activity of ROKα. This approach will help to rationalize new strategies disrupting cell-cell cohesion required for collective cell migration.
Final report
Results in Hungarian
A Prof. Guillaume Charras laboratóriumában elvégzett kutatás célja a sejtek mechanikája és a jelátvitel közötti kapcsolat felderítése volt. Ahhoz, hogy e kapcsolat részleteibe bepillantást nyerjünk, humán köldökzsinór vénából izolált endotél egy-sejtréteg (HUVEC) megnyújtását végeztük el (a réteget annak 30%-ával nyújtottuk meg, 1%/másodperc sebességgel). mCherry fehérjével kapcsolt miozin könnyű lánc (MLC) és az azt foszforiláló kináz, a GFP fehérjével kapcsolt ROKα térbeli elhelyezkedését tanulmányoztuk megnyújtás előtt és után. Felfedeztük, hogy megnyújtás hatására az MLC a nyújtásra merőlegesen elhelyezkedő sejtkapcsolatokból a nyújtással párhuzamos sejtkapcsolatokba mozdul. Előzetes kísérletek alapján a ROKα, mely homogénen oszlik el a sejt citoplazmájában megnyújtás előtt, az MLC-hez hasonlóan, szintén a nyújtással párhuzamos sejkapcsolatokba vándorol. Megállapítottuk, hogy a RAF kinázok családjában tartozó fehérjék megváltoztatják a sejtek viselkedését megnyújtás hatására. BRAF távollétében a sejtek kisebb mértékben „válaszolnak” és hamarabb relaxálnak, míg RAF1 távollétében az MLC elhelyezkedése nem változik a nyújtás hatására. Ezen túlmenően a pályázat lehetővé tette, hogy a kutató betekintést nyerjen egy új, gyorsan növekvő kutatási terület, a mechanobiológia részleteibe, és integrálódhatott egy magas színvonalú, ERC pályázatot nyert kutató laboratóriumába is.
Results in English
The research carried out in the laboratory of Prof. Guillaume Charras aimed to discover the interplay between cellular mechanics and signalling. In order to understand this connection, human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) monolayers have been subjected to mechanical stretch (30% extension, speed: 1%/sec). Localization of myosin light chain 2 (MLC) labelled with and mCherry tag and its upstream kinase ROKα, labelled with a GFP tag, has been monitored before and after stretch. We have discovered that upon stretch, MLC relocalized from the junctions perpendicular to the direction of the stretch and got enriched in the junctions parallel to the stretch. Based on preliminary experiments, ROKα, whose distribution was homogenous in the cytoplasm before stretch, got reorganised and enriched in the junctions parallel to the direction of the stretch, similar to MLC. The influence of RAF family kinases on stretch was found to change the behaviour of the cells upon stretch. BRAF knockdown cells reacted to lesser extent and relaxed faster, while RAF1 knockdown cells failed to mobilize MLC upon stretch. The researcher got insight not only in the new, rapidly increasing research field of mechanobiology, but also got integrated into a high-quality research environment lead by an ERC grant winner.
