Molecular and cellular neuroscience (Council of Medical and Biological Sciences)
40 %
Ortelius classification: Neurobiology
Neuroanatomy and neurophysiology (Council of Medical and Biological Sciences)
40 %
Neuroanatomy and neurophysiology (Council of Medical and Biological Sciences)
20 %
Panel
'Forefront' Research Excellence Program
Department or equivalent
Laboratory of Cellular Neurophysiology (Institute of Experimental Medicine)
Participants
Holderith, Noémi Karlócai, Mária Rita Kirizs, Tekla Kis, Viktor Lőrincz, Andrea Spitzer, Klaudia Sümegi, Máté Gergely
Starting date
2018-01-01
Closing date
2018-09-30
Funding (in million HUF)
55.536
FTE (full time equivalent)
3.42
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. Az emberi agy kimagasló kognitív képességét az őt felépítő idegsejtek és a köztük kialakult szinapszisok funkcionális sokféleségének, valamint az ezekből felépülő hálózat komplex működésének köszönheti. Az elmúlt fél évszázad kutatásai a különböző idegsejtek közötti szinapszisok méretének és funkcionális tulajdonságainak széles skáláját tárták fel, melyek mögött számos eltérő molekuláris mechanizmust sikerült azonosítani. Funkcionálisan eltérő szinapszisok azonban kialakulnak morfológiailag és funkcionálisan azonos idegsejtek közötti kapcsolatok esetében is. A mi munkahipotézisünk az, hogy ennek a funkcionális diverzitásnak az alapja a szinapszisokat felépítő molekuláris háló egyes elemeinek mennyiségi eltérése. Munkánk során egy ilyen, nagy variabilitást mutató kapcsolatot vizsgálunk, melyet a hippokampális CA1 piramissejtjei létesítenek mGluR1α–t kifejező O-LM sejteken. A szinapszisok biofizikai paramétereit több sejtből szinkron in vitro patch-clamp elektrofiziológiai mérésekkel, és kvantális analízissel határozzuk meg. Az egyes szinapszisok molekuláris összetevőit egy újonnan fejlesztett postembedding (beágyazást követő) fluoreszcens immunlokalizációs technikával tervezzük meghatározni. Korrelációt keresünk a molekuláris tartalom és a funkcionális paraméterek között, és az ok okozati összefüggések megállapításához az egyes fehérjék kifejeződésének mértéket genetikai módszerekkel befolyásoljuk. Végül összefüggést keresünk a szinapszisok fiziológiai paraméterei és az őket létesítő sejtek éber állatban észlelt aktivitási mintázata között. Az eredményeink alapján meghatározzuk az egyes szinapszisok funkcionális tulajdonságainak kvantitatív molekuláris ujjlenyomatát.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. Hipotézisünk szerint morfológiailag és molekulárisan homogén sejtcsoportok között létrejött szinapszisok funkcionális heterogenitását az őket felépítő molekuláris háló egyes elemeinek mennyiségi eltérése okozza, mely az idegsejtek eltérő aktivitási múltjának a következménye.
A pályázat fő célja, hogy azonosítsuk az eltérő biofizikai tulajdonságokkal rendelkező hippokampális serkentő szinapszisok molekuláris ujjlenyomatát.
Célkitűzések: 1) Feltérképezni egy hippokampális serkentő szinapszis-populációban a funkcionális paraméterek variabilitását. 2) Új, nagy felbontású fehérje lokalizációs módszer kifejlesztése mely lehetővé teszi a funkcionálisan jellemzett szinapszisok kvantitatív molekuláris vizsgálatát. 3) Biofizikai és molekuláris tulajdonságok közötti összefüggések feltérképezése egyedi szinapszisokban. 4) Ok okozati összefüggések feltárása az egyes szinaptikus fehérjék mennyisége és a vizsgált funkcionális paraméter változása között. 5) Élő viselkedő állatban funkcionálisan jellemzett sejtek közötti szinapszisok biofizikai és proteomikai paramétereinek meghatározása.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! A javasolt kísérletek eredményei nagymértékben hozzájárulnak ahhoz, hogy megértsük az agykérgi szinaptikus kommunikáció működési alapelveit. Célunk, hogy meghatározzuk, hogy a preszinaptikus feszültségfüggő Ca2+ csatornák, a szinaptikus vezikulák felszabadulásában kulcsszerepet játszó fehérje-komplexek, a posztszinaptikus receptorok és azok járulékos alegységei mennyiségében mérhető kvantitatív különbségek milyen módon járulnak hozzá a hippokampális szinapszisok funkcionális diverzitásához. A funkcionális különbségek kvantitatív molekuláris ujjlenyomatainak azonosításával szinapszisok millióihoz fogunk tudni dinamikus funkcionális paramétereket társítani, amikor az ún. array tomográfia segítségével elkészül majd a hippokampusz idegsejtjeinek kapcsolódási térképe (connectome). Továbbá egészséges rágcsálókon kapott eredményeink összehasonlítási alapul fognak szolgálni egyes neurodegeneratív és pszichiátriai betegségek állatmodelljeiben kapott eredményekhez. Laboratóriumunkat a világ vezető laboratóriumai között tartják számon szinapszisok molekuláris, morfológiai és funkcionális elemzésének területén. A mostani pályázat keretében egy kritikus technikai előrelépést valósítanánk meg a szinapszisok egyedi szinten történő proteomikai és funkcionális analízisével. Tudomásunk szerint a molekuláris neuroanatómiai kísérletek hasonló színvonalú vizsgálata csupán néhány más nemzetközi kutatócsoportban folyik, de ezek a laboratóriumok nem rendelkeznek a szinapszisok megfelelő szintű funkcionális jellemzéséhez szükséges feltételekkel és szakértelemmel, így a laboratóriumunk egyedi pozícióban van a szinaptikus működés ilyen szintű tanulmányozásá terén.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. Az emberi agy kimagasló kognitív képessége az őt felépítő idegsejtek kapcsolati hálójának komplexitásában rejlik. Az idegsejtek és az általuk kialakított kapcsolatok nagymértékű változatosságának köszönhetjük, hogy olyan bonyolult számítási feladatot igénylő folyamatok kivitelezésére vagyunk képesek, mint az érzékelés, a koordinált mozgás vagy az információk rögzítése memória formájában és annak ismételt felidézése. A pályázatunk fő célja, hogy megértsük, hogy a szinaptikus kapcsolatok molekuláris változatossága hogyan járul hozzá a szinapszisok működésében észlelt sokszínűséghez. Ennek érdekében ismert idegsejtpárok szinaptikus kapcsolatait fogjuk vizsgálni egyszerre funkcionális és molekuláris módszerekkel egy olyan agyrégióban, mely a memória kialakításáért felelős (hippokampusz). Ez a kombinált eljárás új technológiai fejlesztést igényel, mivel egyetlen jelenlegi lokalizációs technológia sem biztosítja a kellő mértékű felbontás melletti hatékony detekciót. Emiatt egy új molekuláris neuroanatómiai módszert fejlesztünk ki, és az eredményeket nagy feloldású képalkotó módszerrel analizáljuk, mely lehetővé teszi, hogy meghatározzuk a hippokampális serkentő szinapszisok funkcionális paramétereinek molekuláris ujjlenyomatát. Célunk, hogy megértsük az egyes szinapszisok eltérő erősségének az okát. A legmodernebb, élő viselkedő állatban történő funkcionális méréseket kombináljuk in vitro élettani kísérletekkel, hogy teszteljük azt a hipotézist, hogy az idegsejtek aktivitásának múltja határozza-e meg az általuk létrehozott szinapszisok erősségét.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. Our astonishing cognitive abilities are the consequence of complex connectivity within our neuronal networks and the large functional diversity of excitable nerve cells and their synapses. Investigations over the past decades revealed dramatic diversity in shape, size and functional properties among synapses established by distinct cell types in different brain regions. However, synaptic diversity is also observed among synapses established by molecularly and morphologically uniform presynaptic cells on molecularly and morphologically uniform postsynaptic cells. Our hypothesis is that quantitative molecular differences underlie the functional diversity of such synapses. We will focus on hippocampal CA1 pyramidal cell (PC) to mGluR1α+ O-LM cell synapses, which show remarkable functional and molecular heterogeneity. In vitro multiple cell patch-clamp recordings followed by quantal analysis will be performed to quantify well-defined biophysical properties of these synapses. The molecular composition of the functionally characterized single synapses will be determined with the newly developed immunolocalization method. Correlations between the molecular content and functional properties will be established and genetic up- and downregulation of individual synaptic proteins will be conducted to reveal causal relationships. Finally, correlations of the activity history and the functional properties of the synapses will be established by performing in vivo Ca2+ imaging in head-fixed behaving animals followed by in vitro functional characterization of their synapses. Our results will reveal quantitative molecular fingerprints of functional properties of synapses.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. Here we will test the hypothesis that quantitative molecular differences underlie the functional diversity of synapses within homogeneous synaptic connections and that the functional diversity is the consequence of different activity histories of neurons belonging to distinct functional cell ensembles. The general aim of the proposal is to identify the molecular fingerprints defining key biophysical properties of hippocampal glutamatergic synapses. The following specific aims will be addressed: 1) To quantify the variability in the functional properties of a homogeneous population of hippocampal glutamatergic synapses. 2) To develop a high-resolution method that allows quantitative molecular analysis of functionally characterized single hippocampal glutamatergic synapses. 3) To investigate the relationship between the biophysical properties of, and the amounts of synaptic molecules at, individual glutamatergic synapses. 4) To reveal causal links between the quantity of different proteins and defined functional properties of these synapses. 5) To investigate the functional properties and the proteomics of synapses made by functionally characterized nerve cells in behaving animals.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. The results of the proposed experiments will provide a major contribution to our understanding of the mechanisms of synaptic communication in cortical networks. We will determine how quantitative differences in presynaptic Ca2+ channels and release machinery proteins, together with postsynaptic neurotransmitter receptors and their accessory subunits, underlie the functional diversity of hippocampal synapses. Identifying quantitative molecular fingerprints of functional properties will allow us to render dynamic functions to billions of synapses when the connectome of the hippocampal circuit is created using array tomographic reconstructions. In addition, our results obtained from healthy rodents will serve as the foundation of comparisons to those obtained in animal models of neurodegenerative and psychological disorders. Our laboratory is recognized as a world leader in analyzing molecular, structural and functional aspects of central synapses using combined electrophysiological, imaging and ultrastructural approaches. Here, we propose a major technical advance by performing proteomic analysis of functionally characterized individual synapses. We are aware of very few international laboratories who are capable of performing the molecular neuroanatomical experiments at the same standard, but none of them can perform the functional analysis of the synapses at the required details. Thus, the combination of these two cutting edge technologies is the major strength of our proposal, placing it in a unique position.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. The large diversity in nerve cells, in their electrical synapses and complexity of their connections underlie our abilities of performing complex cognitive tasks such as hearing, smelling, thinking or the formation and retrieval of short- or long-term memories. The major aim of the present proposal is to understand the molecular differences among synapses underlying their functional diversity. To achieve this, individual synapses established between well-defined nerve cells of a brain region that is important for memory formation (hippocampus) will be functionally characterized and the molecular content of the very same synapses will be determined. The causal relationships between the function and the amounts of proteins will be tested following genetic up- and downregulation of the proteins. This combined functional-molecular approach requires the development of new technologies, as none of the currently available localization methods is sufficient to accomplish our aims. Thus, we will develop a novel molecular neuroanatomical method and analyze our results with state-of-the-art super-resolution fluorescent microscopy to reveal the molecular fingerprints of functional properties of hippocampal excitatory synapses. We also aim at understanding the reasons for the differences in the strength of the synapses. By using modern in vivo two-photon calcium imaging in behaving mice in combination with in vitro electrophysiology, we will test the hypothesis that the previous activity history of the nerve cells determines the strength of their synapses.
Final report
Results in Hungarian
Eredmenyeink megmutatták, hogy a hippokampális piramissejtek és oriens-lacunosum moleculare interneuronok között lévő posztszinaptikus válaszok nagy variabilitást mutatnak mind az amplitudójukban, rövidtávú plaszticitásukban, kvantális méretben, transzmitter felszabadulási valószínűségben és a transzmitter felszabadulási helyek számában.
A hippokampális piramissejt – gyorstüzelő kosársejt közötti szinaptikus kapcsolatokat is nagy funkcionális változékonyság jellemzi.
Kidolgoztunk egy olyan beágyazás utáni immunlokalizációs módszert amely lehetővé teszi pár tucat szinaptikus fehérje lokalizációját funkcionálisan jellemzett szinapszisokban. A módszer alapja, hogy egy immunfestési és képalkotási lépés után kémiailag eltávolítjuk az ellenanyagokat a mintáról, majd a jelölést-képalkotást megismételjük számos alkalommal egymás után.
In vivo két-foton képalkotási eljárást dolgoztunk ki hippokampális piramissejtek aktivitásának mérésére (genetikailag kódolt GCaMP6f fehérjével) fejbefogott egereken, melyek térbeli navigációs feladatot végeznek virtuális valóságban.
Results in English
We have revealed large variability in the amplitude, short-rem plasticity, quantal size, number of release sites and release probability of synaptic responses evoked by hippocampal CA1 pyramidal cells (PCs) on GABAergic oriens-lacunosum moleculare interneurons.
We have identified large variability in the amplitude and short-term plasticity of EPSCs evoked by hippocampal CA1 PCs on GABAergic fast-spiking basket interneurons.
We have developed a postembedding immunolocalization method of synaptic proteins in functionally characterized synapses. This method allows the sequential immunolabelling of dozens of proteins in individual synapses following many elution – restaining steps.
We have implemented two-photon Ca2+ imaging in hippocampal CA1 PCs expressing GCaMP6f in head-restrained mice while navigating in virtual linear tracks.
