Epidemiology, veterinary microbiology (Council of Complex Environmental Sciences)
100 %
Panel
Plant and animal breeding
Department or equivalent
Institute for Veterinary Medical Research (Centre for Agricultural Research)
Participants
Bali, Krisztina Csoma, Eszter Domán, Marianna Forró, Barbara Kaszab, Eszter Kugler, Renáta Marton, Szilvia Nagy, Borbála Ágnes
Starting date
2017-12-01
Closing date
2019-11-30
Funding (in million HUF)
19.984
FTE (full time equivalent)
4.57
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. A rotavírusokat a Reoviridae családba soroljuk, mely kilenc ratifikált (RVA – RVI) és egy újonnan javasolt speciest (RVJ) foglal magába. A két legutóbb leírt rotavírus faj (RVI és RVJ) felfedezésében és leírásában kutatócsoportunknak meghatározó szerepe volt. A rotavírusok legelterjedtebb és legjobban ismert képviselői a RVA fajba tartoznak, melyek emlősökben és madarakban egyaránt előfordulnak. A többi rotavírus (RVB-RVJ) gazdaspektruma jelenlegi ismereteink szerint jóval szűkebb ennél.
A RVA törzsek evolúciójuk során számos, egymást komplementáló mechanizmust fejlesztettek ki a gazdaszervezet immunválaszadó képességének gátlására. A vírus egyik legfontosabb eszköze ebben a küzdelemben az NSP1 fehérje. Az RVA NSP1 egy E3 ubiquitin ligáz, mely a patogén mintázat felismerésének szintjétől kezdve, az interferon (IFN) kaszkád szignálfolyamatainak intermedierjein át a transzkripció szintjéig képes gátolni a sejt vírusszaporodással interferáló mechanizmusait. A RVB-RVJ (azaz non-RVA) törzsek esetében az NSP1-szerű géntermékek szekvenciája a RVA NSP1 fehérjéjétől akár 90%-ban is eltérhetnek; ezek funkciójára vonatkozóan hiányoznak az ismeretek. A pályázat alapját képező közleményünkben új non-RVA törzseket (RVI) írtunk le; ezek a teljes genom szintjén alacsony szekvencia homológiát mutattak a korábban jellemzett rotavírus fajok képviselőivel, beleértve az NSP1-szerű fehérjét is, mely 11% szekvencia azonosságot mutatott a RVA NSP1 fehérjéjével.
Vizsgálataink célja, hogy meghatározzuk a non-RVA (köztük az általunk leírt RVI) törzsek NSP1-szerű fehérjéinek lehetséges szerepét a sejt IFN-termelés gátlásában.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. A kutatás alapkérdései a következők: 1. Szerepe van-e a non-RVA törzsek genomjának 5. szegmensén kódolt NSP1-szerű fehérjéknek az IFN termelés gátlásában? 2. Melyek az IFN-kaszkád azon elemei, amelyeket az intracellulárisan expresszált NSP1-szerű fehérjék kikapcsolnak/bekapcsolnak? 3. Mely sejtorganellumok a célállomásai a non-RVA törzsek NSP1-szerű fehérjéinek? 4. Egyes rotavírus speciesek 5. génszegmense monocisztronos, másoké bicisztronos. Mi lehet az előnye/hátránya ennek a strukturális különbségnek?
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! A rotavírusok a hasmenéses megbetegedések egyik fő okai világszerte emberben és számos állatfajban egyaránt. A RVA fertőzés ellen ma vakcinákat használunk; e vakcinák használata elterjedt, de csak az RVA okozta fertőzések ellen hatásosak.
A non-RVA vírusok közül az RVB emberben és szarvasmarhában, az RVC emberben, sertésben és kutyában, az RVE sertésben, az RVH emberben és sertésben, az RVI kutyában és macskában, az RVJ denevérben, míg az RVD, RVF és RVG háziszárnyasokban és vadmadarakban fordul elő. A non-RVA fertőzések egy része dokumentáltan szerepet játszik enterális tünetek kialakításában és hasmenéses járványkitörések létrejöttében. A prevenció és infekció-kontroll eszközei, a terápiás lehetőségek azonban nincsenek kidolgozva. Sőt, minthogy ezek a vírusok – kevés kivétellel – jelenleg a nem-szaporítható vírusok közé tartoznak, biológiájukról is kevés ismeret áll rendelkezésre.
Ennek megfelelően annak kísérletes úton történő demonstrálása, hogy a non-RVA NSP1-szerű fehérjék szerepet játszanak az IFN antagonizmusban új ismereteket jelentene a virológiai alapkutatásban. Ráadásul ez a felismerés segíthet új terápiás célpontok azonosításában is. Nevezetesen, még ha a humán és állatorvosi medicinát a non-RVA vírusokkal kapcsolatban vakcina-fejlesztés nem is, de a terápiás lehetőségek feltárása bizonyosan érdekelheti. A non-RVA NSP1-szerű fehérjéi, amennyiben szerepük az anti-IFN válaszban igazolást nyer, új terápiás célponttá is válhat azáltal, hogy a fehérje működésének csendesítésével/kiiktatásával a sejt antivirális effektor-funkciói hatékonyabbá tehetőek.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. A hasmenéses megbetegedések jelentős hányadát rotavírusok okozzák, emberben és háziállataiban egyaránt. A tudomány ma közel egy tucat rotavírusfajt (RVA-RVI és további jelöltként a RVJ) különít el, de ismereteink nagyrészt csak a RVA faj vírustörzseire korlátozódnak. A tervezett kutatás a kevéssé ismert rotavírusokra koncentrálna, azok biológiai sajátságairól szeretnénk újabb ismereteket szerezni. Azokat a mechanizmusokat vizsgáljuk majd, amelyeket a rotavírusok azért fejlesztettek ki, hogy kibújjanak a sejt által genetikailag kódolt vírusellenes effektor funkciók alól. A vizsgálatok eredményei segíthetnek jobban megérteni, hogy mely vírusfehérjék felelnek ezért a hatásért és ezáltal segíthetnek újabb terápiás célpontok azonosításában is.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. Rotaviruses are classified into the family Reoviridae, which includes nine ratified (RVA to RVI) and one newly proposed species (RVJ). The first representatives of two species, RVI and RVJ, were discovered and described by our research group. The most widespread and most well characterized representatives of rotaviruses belong to the species RVA, which occur both in mammals and birds. The host spectrum of other rotaviruses (ie. RVB to RVJ) is considerably narrower.
During their evolution RVA strains developed multiple mechanisms to suppress the immune response of host organism. One of the most important tool of the virus in this process is a non-structural protein, NSP1. The NSP1 of RVA is a E3 ubiquitin ligase, which is able to inhibit the cellular mechanisms responsible for antiviral defense from the pathogen pattern recognition, through the signal intermediates of IFN cascade to the level of transcription. In case of strains belonging to RVB to RVJ (i.e. non-RVA) the NSP1-like gene products may show up to 90% sequence divergence; the question how these proteins function is open.
The primary objective of our study is to determine the possible role of non-RVAs (including the newly discovered RVIs) NSP1-like protein in interferon antagonism.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. The main questions of the research are the follows: 1. Is there a role of the NSP1-like proteins encoded by the fifth genomic segment of non-RVAs in the inhibition of IFN production? 2. Which elements of the IFN-cascade are down-/upregulated in response to intracellular expression of NSP1-like proteins? 3. In which cellular organelles are NSP1-like proteins of non-RVA strains accumulate? 4. The fifth genome segment of rotaviruses may be either mono- or bicistronic. What is the advantage/disadvantage of this structural difference?
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. Rotaviruses are a major cause of acute gastroenteritis worldwide in humans and a variety of animal species. Clinical manifestations of RVA infections can be prevented by vaccination; these vaccines are broadly utilized, but provide protection exclusively against infection caused by RVA strains.
Host species distribution of non-RVA shows the following pattern: RVB, humans and cattle; RVC, humans, pigs and dogs; RVE, pigs; RVH, humans and pigs; RVI, dogs and cats; RVJ, bats; RVD, RFV, and RVG, domestic poultry and wild birds. Non-RVAs have been described from clinical cases of diarrhea and may be responsible for gastroenteritis outbreaks. Measures of prevention and infection control or therapy against clinical manifestations have not been elaborated for non-RVAs. Moreover, given that non-RVAs – with few exceptions – are non-cultivable viruses, little is known about their biological properties.
Consequently, experimental data that would indicate that NSP1-like proteins of non-RVAs play a role in interferon antagonism would be important to understand key features of rotavirus biology and would, in general, extend knowledge for the field virology. In addition, demonstration of NSP1-like proteins function in interferon antagonism may help identify new solutions for therapy of non-RVA infections. In particular, even if vaccine development may not be a priority for human or veterinary medicine, exploration of new therapeutic opportunities would be interesting for the pharmaceutical market. The NSP1-like proteins of non-RVAs, should their role in interferon antagonism be proven, could serve as new therapeutic targets by silencing/shutingoff of their action and thereby enhancing the effector functions of the cellular antiviral mechanisms.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. Rotaviruses are responsible for a large proportion of acute dehydrating diarrhea in both humans and domesticated animals. Science distinguishes nearly a dozen different rotavirus species (RVA-RVI and the candidate RVJ), yet scientific interest has mainly focused on virus strains classified into RVA. The planned research would focus on non-RVAs by generating new scientific knowledge concerning their biological properties. We plan to study those mechanisms which were evolved to help rotaviruses to avoid the effector functions of innate immunity encoded by host cells. Results of this research may help better understand which viral proteins are responsible for these functions and thereby may help identify new targets of antiviral therapy.
Final report
Results in Hungarian
Vizsgálataink célja az volt, hogy meghatározzuk egyes non-RVA törzsek NSP1-szerű fehérjéinek lehetséges szerepét a sejt IFN termelésének gátlásában. Több sejt típust felhasználva végeztük vizsgálatainkat. NSP1 homolog inszertet tartalmazó plazmid transzfektálása után mértük az IFN-beta expressziót faj-specifikus Taqman assay segítségével.
A CRFK és LMH sejtekben nem figyeltünk meg poli I:C által kiváltott IFN termelést, az MDCK és PK15 sejtekben volt ugyan IFN indukció, de a vizsgált rotavírus NSP1 gének nem okoztak csökkenést az IFN gén kifejeződésében. A kutya eredetű A72 sejtvonalon a fajidegen (denevérből kimutatott) RVJ NSP1 40%, a fajazonos (kutyából kimutatott) RVC és RVI NSP1 36% illetve 83% csökkenést idézett elő az IFN gén transzkripciójában.
A RVA NSP1 génen alapuló szakirodalmi adatok alapján jelentős IFN redukciót vártunk. Az általunk vizsgált non-RVA NSP1 gének azonban jóval kisebb mértékű csökkenést idéztek elő az IFN gén transzkripciójában. Az eltérés mögött több magyarázat is lehetséges. Az alkalmazott kísérleti rendszerek eltérőek voltak és elképzelhető, hogy az itt használt sejttípusok, azok eltérő gazda- és szervi eredete miatt kevéssé voltak alkalmasak a célkitűzésekben feltett kérdések megválaszolására. Lehetséges továbbá, hogy a non-RVA törzsek egy részénél az NSP1 fehérje nem ugyanazt a feladatot látja el, mint az RVA törzseké, vagy ha mégis, akkor a folyamat hatékonyságában lehetnek jelentős eltérések.
Results in English
The objective of our research was to determine the possible role of NSP1 homologs of selected non-RVA strains in the reduction of IFN expression. We used multiple cell types. Following transfection of plasmids containing the NSP1 homologs we measured the expression of IFN-beta gene by using species specific Taqman assay.
In some cells (CRFK, LMH) we observed no IFN expression following treatment with poli I:C, in other cells (MDCK, PK15) poli I:C induced IFN expression but the NSP1 homologs could not reduce the level of IFN mRNA. The canine origin A72 represented a heterologous cell type for the bat origin RVJ NSP1, yet a 40% reduction of IFN expression was measured when analyzing the effect of the RVJ NSP1 homolog. Furthermore, the canine RVC and the canine RVI NSP1 homologs also reduced the IFN-beta expression by 36% and 83%, respectively.
Based on literature data available for RVA we expected more significant reduction in IFN expression in cell culture. Although at present we cannot explain the difference in the IFN reduction capacity between RVA and selected non-RVA NSP1 proteins, we assume that the experimental setup may have influenced our findings. It is also possible that the primary function of the proteins encoded by genome segment 5 in various non-RVA species may differ from those functions assigned to the NSP1 of RVA or even if the function is shared the efficacy of this function may show differences among strains.
