dNTP pool, cell wall biosynthesis, genotoxic stress, resistance mutations
Discipline
DNA synthesis, modification, repair, recombination and degradation (Council of Medical and Biological Sciences)
80 %
Microbiology: virology, bacteriology, parasitology, mycology (Council of Medical and Biological Sciences)
20 %
Ortelius classification: Medical microbiology
Panel
Molecular and Structural Biology and Biochemistry
Department or equivalent
Institute of Molecular Life Sciences (Research Center of Natural Sciences)
Participants
Tóth, Judit
Starting date
2018-09-01
Closing date
2022-07-31
Funding (in million HUF)
15.807
FTE (full time equivalent)
2.47
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. A dezoxinukleotid 5’-trifoszfátok (dNTP-k) koncentrációjának finomhangolt szabályozása elengedhetetlen a DNS bioszintéziséhez. Az egyensúly felbomlása megnövekedett mutációs gyakorisághoz vezethet. Ezenkívül a sejtfal bioszintézis is nagyban függ a dNTP készlet egyensúlyától, ugyanis a dTTP fontos alkotóeleme a bakteriális sejtfalnak. Modellünk a Mycobacterium smegmatis: e baktérium a tuberkulózis kórokozójának (Mycobacterium tuberculosis) közeli rokona, és azzal megegyező anyagcsere és DNS-hibajavító útvonalakkal rendelkezik. Az intracelluláris kórokozó tuberkulózis baktériumot a gazda immunsejtjeinek fagoszómáiban erős stressz hatások érik az immunválasz részeként és a gyógyszeres kezelés hatására is. A baktérium számára ezért kiemelkedő fontosságú a genotoxikus környezeti feltételekhez való alkalmazkodás. A genotoxikus stresszhatások elkerülése rezisztencia mutációk létrejöttével és átjárhatatlan sejtfaluk segítségével is lehetséges. Ezen alkalmazkodási stratégiák felderítésére három specifikus célt jelöltünk ki: 1. Meghatározzuk a környezeti stressz és a sejtbeli dNTP készlet mérete, illetve eloszlása közötti összefüggéseket. 2. Meghatározzuk a dNTP készlet megváltozásának függvényében megjelenő mutációs mintázatokat és indukált DNS javító útvonalakat. 3. Megvizsgáljuk a dTTP nukleotid szerepét a baktérium sejtfal szintézisében. Eredményeink révén megismerhetjük a dNTP homeosztázis fenntartásának mechanizmusát, illetve az egyensúly felborulásának okait és következményeit. Megérthetjük továbbá, hogy a dNTP készlet változásai hogyan járulnak hozzá a genotoxikus stressz adaptáció és a drogrezisztencia kialakulásához.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. Vizsgálataink során arra szeretnénk fényt deríteni, hogyan befolyásolják a genotoxikus stressz hatások a dNTP készlet szabályozását, illetve hogyan függ össze a dNTP készlet szabályozása a DNS-hibajavítás útvonalaival, valamint a sejtfal bioszintézissel mikobaktérium modellszervezetben. Hipotézisünk szerint a sejtbeli dNTP készlet szabályozása fontos eleme lehet a genotoxikus környezeti feltételekhez történő alkalmazkodási stratégiának. Az 1. részprojekt kísérleteiben meghatározzuk, hogy a környezeti stressz tényezők hogyan hatnak a sejtbeli dNTP készlet méretére és eloszlására. A 2. részprojektben végzett kísérleteinkkel feltárjuk a dNTP készlet stressz indukált megváltozása által kiváltott mutációs mintázatokat és indukált DNS-hibajavító útvonalakat. A 3. részprojektben pedig megvizsgáljuk hogyan hat a dTTP szint megváltozása a sejtfal bioszintézis folyamatára. Összességében a projekt eredményei feltárják a finomhangolt sejtbeli dNTP egyensúly fenntartásának illetve a felborulásának mechanisztikus okait és következményeit. Az eredmények révén megérthetjük, hogy a dNTP-készlet változásai hogyan járulnak hozzá a mikobaktériumok genotoxikus stressz adaptációjához és drogrezisztenciájához.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! A drog rezisztens törzsek terjedése miatt a tuberkulózis világszerte jelentős egészségügyi kockázatot jelent. A bakteriális drogrezisztencia általában horizontális géntranszfer révén terjed. Ezzel szemben mikobaktériumokban, mint pl. a tuberkulózis kórokozója, a drogrezisztencia elsősorban mutációk révén alakul ki. Mivel a mikobaktériumok normál mutációs rátája alacsony, külső faktorok – például a drogok okozta genotoxikus stressz – válthatják ki a megnövekedett mutációs gyakoriságot, amely hozzájárul a genotoxikus stressz adaptációhoz. A mutáció indukáló mechanizmusok megértése ezért jelentősen elősegítheti a drogrezisztencia hatékonyabb kezelését és a jelenlegieknél hatékonyabb kombinációs terápiák kialakítását. Projektünk alapkutatási jelentősége, hogy elsőként végzünk olyan vizsgálatokat, amelyek feltárják a dNTP készlet változásainak összefüggéseit a belső és környezeti stressz hatásokkal, a DNS-hibajavítással, valamint a sejtfal bioszintézisével. A közelmúltban a dNTP készlet homeosztázis új szerepeire derült fény olyan fontos területeken, mint például a HIV fertőzés elleni védekezés, a sejtciklus szabályozás, a rákprogresszió és az öregedés. Ezért nagy jelentősége van azon mechanizmusok feltárásának, amelyek révén a DNS építőkövek koncentráció viszonyaiban bekövetkezett látszólag egyszerű változások olyan komplex jelenségekhez vezetnek, amelyek élet-halál kérdést jelenthetnek az adott sejt vagy szervezet számára.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. A sejtek a genetikai anyag építőköveiből, a nukleotidokból rendelkezésre álló készletet precíz szabályozás alatt tartják. Ez olyan komplex folyamatokat képes döntően befolyásolni, mint például a HIV fertőzés elleni védelem, a rákprogresszió illetve az öregedés. Hipotézisünk szerint a nukleotid készlet szabályozása fontos szerepet játszik a tuberkulózis-kórokozó baktériumok gyógyszer-rezisztenciájának kialakulásában is. A gyógyszer-rezisztens baktériumtörzsek terjedése miatt a TBC ma is világszerte jelentős egészségügyi probléma. Célunk, hogy felderítsük annak mechanizmusát, hogy a jelenleg alkalmazott tuberkulózis gyógyszerek hogyan indukálnak a baktériumokban a rezisztenciához vezető mutációkat. A stressz tényezők mutációkra gyakorolt hatásának szisztematikus vizsgálatához modellszervezetként a tuberkulózis-baktérium közeli rokonát használjuk, amely a kórokozóéval megegyező anyagcsere útvonalakkal rendelkezik. A kísérleteinkben alkalmazott stressz hatások között szerepelnek a jelenleg alkalmazott tuberkulózis gyógyszerek is. Felderítjük a stressz hatására a nukleotid készletben bekövetkezett változásokat. Ezután felderítjük a környezeti stressz tényezők hatására bekövetkezett nukleotid készlet változások okozta mutációkat. Végül megvizsgáljuk a nukleotid készlet szabályozásának szerepét a baktérium sejtfal szintézisében. Ezáltal közelebb juthatunk a gyógyszer rezisztencia kialakulásának megértéséhez.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. Precise regulation of the level and ratio of deoxyribonucleoside 5’-triphosphates (dNTPs) are needed for accurate and faithful DNA biosynthesis. dNTP pool changes often results in increased mutation frequency. In addition, cell wall biosynthesis also highly depends on dNTP balance as dTTP is an important component of the biosynthesis pathway. Our model Mycobacterium smegmatis shares the metabolic and repair pathways with the tuberculosis bacterium, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Mtb is exposed to harsh genotoxic conditions by the host immune defense. It is therefore of major importance for these bacteria to develop strategies for the adaptation to genotoxic environmental conditions or avoid these genotoxic conditions by their impermeable cell wall. To reveal these strategies, we defined three specific aims. 1) We will establish the relationship between the exposure to environmental stress, comprising currently used drugs, and the changes in size and balance of the cellular dNTP pool. 2) We will define the mutational pattern and DNA repair induction pathways in function of dNTP pool imbalances and expansion. 3) We will investigate the role of dTTP levels in cell wall biosynthesis. The synthesis of the results is expected to unveil the mechanistic reasons behind the necessity of a fine tuned dNTP balance and the consequences of imbalance. We hope to understand how the changes in the dNTP pool possibly promote drug resistance as part of the adaptation to genotoxic stress.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. The basic question of the proposed research is how dNTP pool regulation is linked with genotoxic stresses, DNA repair pathways and cell wall biosynthesis in the mycobacterial model. Our hypothesis is that dNTP regulation presents as a strategy for the adaptation to genotoxic environmental conditions. The experiments planned in Aim 1 will establish the relationship between environmental stresses and the changes in size and balance of the cellular dNTP pool. Stress factors will comprise the currently used drugs against tuberculosis as well. The experiments planned in Aim 2 will reveal the mutational pattern and DNA repair induction pathways in function of dNTP pool imbalances and expansion upon stress exposure. Finally, in Aim 3 we will investigate the stringency of this balance and connect to cell wall biosynthesis. The results of Aims 1-3 in concert will shine light on the mechanistic reasons for a fine tuned cellular dNTP balance and the consequences of imbalance. The results will help to understand how dNTP pool changes possibly promote drug resistance, an instance of adaptation to genotoxic stress in mycobacteria comprising Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. Tuberculosis presents as a worldwide health threat due to the massive spreading of drug resistant strains. Drug resistance often occurs via horizontal gene transfer, however in mycobacteria, comprising the causative agent of tuberculosis, drug resistance emerges primarily via point mutations. As the basic mutation rate in mycobacteria was measured to be low, external factors, including for example the genotoxic stress upon drug treatment may induce a higher rate of mutations as adaptation to the genotoxic stress. The investigation of mutation-inducing mechanisms will therefore lead to a possible better management of drug resistance and of the current therapies. From a basic research point of view, systematic studies on dNTP pool regulation linking endogenous and environmental stresses to dNTP pool changes and in turn to DNA repair and cell wall biosynthesis are missing. Our knowledge has only recently been expanded on new roles of dNTP pool homeostasis including defense against HIV infections, cell cycle control, oncogenic progression and aging. It is of great interest to reveal the mechanisms by which the simple concentration relations of DNA building blocks lead to complex phenomena determining life and death of a cell.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. Cells maintain a definite pool of the nucleotide building blocks of their genome. The regulation of this pool has recently been proposed to influence complex phenomena including defense against HIV infections, oncogenic progression and aging. Our hypothesis is that nucleotide pool regulation is also related to the emergence of drug resistance in the tuberculosis bacteria. Tuberculosis remains a worldwide health issue due to the massive spreading of drug resistant strains. Our goal is to offer a mechanism by which current tuberculosis drugs induce mutations leading to resistance via the systematic investigation of dNTP pool changes and its consequences. We use a non-pathogenic model, a close relative to the causative agent of tuberculosis, to carry out our investigations. We will apply various environmental stresses including the currently used tuberculosis drugs on the model bacteria then we will measure the changes arising in their nucleotide pool. Then, we will analyze the mutations induced by the environmental factors and nucleotide pool changes. Finally, we will investigate the effect of cellular nucleotide levels for cell wall biosynthesis in the bacterium. Our expectation is that this complex analysis will shine light on the mechanisms leading to drug resistance.
Final report
Results in Hungarian
A stressztolerancia és a genetikai variabilitás TB túlélési stratégiákban betöltött jelentőségének felderítésére szisztematikusan megvizsgáltuk a jelenleg használt antibiotikumok és környezeti stressztényezők hatását Mycobacterium smegmatis modellre. Megállapítottuk, hogy a mikobakteriális genom nagyon stabil, a mutációs ráta alacsony, még stressz- vagy gyógyszeres kezelések hatására sem látunk jelentős növekedést a mutációs rátában. Nagy genetikai variabilitást találtunk (még egysejtkolóniából indult tenyészetben is). Az adott kezelés hatására jellegzetes celluláris dNTP koncentráció változásokat és különböző enzim aktiválódási mintázatokat tudtunk detektálni. A kezelések következményeként jelentős mértékű tolerancia alakult ki, és a genomban már fellelhető változatok közül a környezeti feltételekhez legjobban alkalmazkodó változatok fixálódtak.
A projekt második részében a dNTP homeosztázis és a sejtfal bioszintézis közötti összefüggéseket vizsgáltuk. Azt találtuk, hogy az ramnóz bioszintézis perturbációja a sejtmorfológiában és a dTTP-készletben is hibát okoz. Arra következtetünk eredményeinkből, hogy a sejtfal bioszintézise és a replikáció között valamilyen kommunikáció van. Szuper-rezolúciós mikroszkóppal vizsgálva az RmlA fehérje a sejt pólusán kívül a sejt teljes hosszában spirális mintázatban lokalizálódik. Eredményeink azt mutatják, hogy az RmlA szerepet játszhat a sejtalak meghatározásában, egy idáig még ismeretlen mechanizmussal mikobaktériumokban.
Results in English
To gain new insights into the connections between stress tolerance, genetic variability, and the significance of these phenomena in TB survival strategies, we systematically investigated the effects of currently used antibiotics and environmental stress factors on Mycobacterium smegmatis. We found that the mycobacterial genome is very stable, the mutation rate is unprecedentedly low, even upon harsh stress- or drug treatments. There is large genetic variance, even in a culture started from a supposedly single cell colony. In response to the given treatment, characteristic cellular dNTP concentration changes appeared and different sets of enzymes are activated specifically promoting phenotypic resistance and protecting genomic integrity. Phenotypic resistance development is significant and already existing variants are likely to expand as an adaptation to environmental conditions.
In the second part of the project, the connections between dNTP homeostasis and cell wall biosynthesis were investigated. We found that perturbation of rhamnose biosynthesis results in defects in cell morphology and cellular dTTP pool. We also observed indications for crosstalk between cell wall biosynthesis and replication. Using super-resolution microscopy, we found that RmlA localizes throughout the whole cell length in a helical pattern in addition to the cellular pole. Our results indicating that RmlA plays a role in determining cell shape driven by a yet unknown mechanism in mycobacteria.
R. Hirmondó, B. S. Mébold, J. Tóth: Investigation of the specific role of dTTP homeostasis in mycobacterial cell wall biosynthesis, 2018. 09. 02-05. FEBS3+ conference, Siófok, 2018
R. Hirmondó, É. V. Surányi, D. Molnár, Á. Horváth, B. G. Vértessy, J. Tóth: Investigation of the mutator effects of various genotoxic stresses provides insight into the mechanism of drug resistance development in Mycobacteria, 2019. 03. 29-31. Hungarian Molecular Life Sciences Conference, Eger, 2019
R. Hirmondó, Á. Horváth, J. Tóth: Cellular dTTP homeostasis provides a possible checkpoint between replication and cell wall biosynthesis in mycobacteria, 2019. 06. 09-12. EMBO Workshop: Bacterial cell division: Closing the gap, Lund, Sweden., 2019
Molnar D., Suranyi E. V., Hirmondo R., Galik N., Toth J.: The effects of genotoxic stress factors on DNA-repair system in Mycobacteria, FEBS OPEN BIO 9: pp. 154-154., 2019
Hirmondó Rita, Horváth Ármin, Molnár Dániel, Török György, Nguyen Liem, Tóth Judit: The effects of mycobacterial RmlA perturbation on cellular dNTP pool, cell morphology, and replication stress in Mycobacterium smegmatis, PLOS ONE 17: (2) e0263975, 2022
Rita Pancsa, Erzsébet Fichó, Dániel Molnár, Éva Viola Surányi, Tamás Trombitás, Dóra Füzesi, Hanna Lóczi, Péter Szijjártó, Rita Hirmondó, Judit E Szabó, Judit Tóth: dNTPpoolDB: a manually curated database of experimentally determined dNTP pools and pool changes in biological samples, NUCLEIC ACIDS RESEARCH 50: (D1) pp. 1508-1514., 2022
Molnar D., Suranyi E. V., Hirmondo R., Galik N., Toth J.: The effects of genotoxic stress factors on DNA-repair system in Mycobacteria, FEBS OPEN BIO 9: pp. 154-154., 2019
