 |
Consortional assoc.: Multiorgan modelling of DiGeorge syndrome by pluripotent stem cells
|
Help 
Print 
|
Here you can view and search the projects funded by NKFI since 2004
Back »
|
| |
Details of project |
|
|
| Identifier |
128444 |
| Type |
K |
| Principal investigator |
Földes, Gábor |
| Title in Hungarian |
Konzorcium, társ p.: A diGeorge szindróma többszervi modellezése |
| Title in English |
Consortional assoc.: Multiorgan modelling of DiGeorge syndrome by pluripotent stem cells |
| Keywords in Hungarian |
Betegségmodellezés, pluripotens őssejt, irányított differenciáció, DiGeorge szindróma |
| Keywords in English |
disease modelling, pluripotent stem cells, directed differentiation, DiGeorge syndrome |
| Discipline |
| Biological basis of diseases related to the above (Council of Medical and Biological Sciences) | 70 % | | Stem cell biology (Council of Medical and Biological Sciences) | 30 % |
|
| Panel |
Cellular and Developmental Biology |
| Department or equivalent |
Városmajori Szív- és Érgyógyászati Klinika (Semmelweis University) |
| Participants |
Gara, Edit
Haltrich, Irén
Merkely, Béla
Molnár, Andrea Ágnes
Nemes, Annamária
|
| Starting date |
2018-12-01 |
| Closing date |
2022-11-30 |
| Funding (in million HUF) |
22.000 |
| FTE (full time equivalent) |
8.40 |
| state |
closed project |
Summary in Hungarian A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
A betegségek pathomechanizmusának jobb megértése elengedhetetlen a hatékony kezeléshez. Számos betegség esetében jól használható állat- és in vitro modellek állnak rendelkezésre, ugyanakkor vannak olyan betegségek, amelyek esetében új megközelítésekre van szükség. Azon komplex betegségek esetében, amelyek hátterében álló genetikai, fejlődésbiológiai és funkcionális eltérések nem tisztázottak különösen hasznos eszköz az indukált pluripotencián alapuló betegségmodellezés. Jelen pályázatban azt a célt tűztük ki, hogy a részleges kromoszómális deléció okozta, több szervet érintő DiGeorge szindrómás betegek (és kontrollként egészséges felmenőik) vérsejtjeiből humán indukált pluripotens sejteket (hiPSC) hozunk létre, majd az hiPSC-kből több, a betegségben érintett sejttípust (endothel, szívizom) differenciáltatunk. A betegekből származó és a kontroll sejttípusok között (pluripotens, progenitor és differenciált állapotban) különbségeket keresünk mRNS, fehérje és funkcionális szinten is. Fontos kérdés, hogy egy ilyen komplex betegség esetében a fenotípus nyomon követhető-e in vitro tenyészetekben, valamint hogy a funkciók, így az érképző képesség vagy a Ca-szignalizáció, hogyan befolyásolhatók farmakológiai szerekkel. Mivel a kiválasztott páciensek (nagyapa, anya és lánya) tünetei jelentősen eltérnek, vizsgálni fogjuk, hogy a betegség súlyossága és az in vitro fenotípus között találunk-e összefüggést. A projekt során kontroll hiPSC-ből a CRISPR rendszer segítségével szelektíven kiütjük a betegségben érintett, a mikroRNS érésben szerepet játszó DGCR8 génjét, és vizsgáljuk, hogy ennek milyen hatása van a differenciációra.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
Az indukált pluripotens őssejtekből kiinduló betegségmodellezés azon alapul, hogy betegek szomatikus sejtjeiből mester transzkripciós faktorok segítségével embrionális állapotba visszaprogramozott sejteket (iPSC) hozunk létre, majd ezekből a betegségben érintett sejttípusokat differenciáltatunk és ezeken vizsgáljuk a betegség megjelenését. Jelenleg a felhasználhatóságát és korlátait térképezzük fel ennek az új és nagyon dinamikusan fejlődő kutatási területnek. Ebben a pályázatban arra keressük a választ, hogy egy komplex betegség (DiGeorge szindróma) vizsgálható-e és milyen módszerekkel ebben a modellrendszerben. Arra vagyunk kíváncsiak, hogy az egyes betegség által érintett sejttípusokban (endothel, szívizom) in vitro jelentkeznek-e különbségek a betegből és az egészséges kontrollból származó sejtek között, és ha igen, milyen szinten (mRNS, fehérje, funkció). Továbbá, hogy befolyásolhatóak-e ezek az eltérések farmakológiai szerekkel. Kísérleteket tervezünk 3D endothel-szívizom ko-kultúrák vizsgálatára, hogy a sejtek közötti kapcsolatokban bekövetkező változásokat is feltérképezhessük. Arra is választ keresünk, hogy a DGCR8, egy a DiGeorge szindrómában kieső gének közül, milyen befolyással van a különböző differenciációs folyamatokra. Ezt a gént géneditálási technikával fogjuk eltávolítani a kontroll sejtvonalból. A DGCR8 a mikroRNS érés klasszikus útjának kulcsfehérjéje és így arra kaphatunk választ, hogy a mikroRNS érés sérülése milyen hatással van a sejtek érésére és mennyiben járul hozzá a DiGeorge szindrómában megjelenő eltérésekhez.
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
A monogénes betegségek esetében ma már széles körben használják az őssejtalapú betegségmodellezést. Ezek a tanulmányok igazolták, hogy a betegségre jellemző fenotípusok és a már kipróbált szerek hatása jól reprodukálható in vitro tenyészetekben is. A több gént érintő, környezeti hatásokkal is kapcsolt, több szervet és/vagy nehezen vizsgálható sejttípusokat érintő betegségek kutatása új és komplexebb megközelítést igényel. Az általunk választott mikrodeléciós betegség (DiGeorge szindróma) ilyen, sok gén kiesésével járó, több szervet, köztük a kardiovaszkuláris és a központi idegrendszert is érintő kórkép, és várhatóan in vitro is megjelenő fenotípust okoz. Létezik a betegség állatmodellje és az érintett szervek fejlődését vizsgálták is, de a szindróma humán vonatkozásai így nehezen határozhatóak meg és kevés a betegség sejtszintű vizsgálatára irányuló kutatás. Leírtak már DiGeorge szindrómás betegből készült iPSC vonalat is, de azon csak az idegsejtek érését tanulmányozták. Mi több sejttípus együttes vizsgálatát tervezzük, és olyan családot vizsgálunk, ahol a nagyapa, az anya klinikai képe enyhe, míg a gyermeké súlyos, így lehetőségünk nyílik a DiGeorge betegség különböző súlyosságú eseteit vizsgálni, ahol a genotípus-fenotípus összefüggéseit kereshetjük. Az egészséges nagyanya és apa kontrollként való bevonásával további adatok gyűjthetők a beteg és egészséges sejtek fenotipikus különbségeiről, ami a betegség mechanizmusának megismerésében és a lehetséges diagnosztikai/terápiás fejlesztésben segít. Ezen a területen előnyt jelent, hogy a pályázat az SE Klinikáin és az MTA-n dolgozó szakemberek együttműködéseként valósul meg. Az iPSC alapú betegségmodellek esetében a legtöbb vizsgálat mRNS vagy fehérje szintű eltéréseket keres az egészséges és beteg minták között. Jelen pályázatban ezen túlmenően olyan funkcionális kutatásokat is tervezünk (érképződés, Ca-szignálok, 3D ko-kultúrás endothel-szívizom tenyészetek), amelyek közelebb visznek a betegség mechanizmusának megértéséhez, és amelyeket a már sikeresen alkalmaznak kutatásaikban. A pályázatban létrehozott in vitro modellek (DiGeorge és DGCR8 hiányos iPS sejtek) további alapkutatási és fejlesztési vizsgálatban is felhasználhatók lesznek.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
A humán pluripotens őssejtvonalak laboratóriumban korlátlan ideig szaporíthatók és a tenyésztési körülmények megváltoztatásával képesek a testünket felépítő sejttípusok létrehozására. E két tulajdonságuk alapján kiváló modellként szolgálnak fejlődésbiológiai kérdések megválaszolására, új tesztrendszerként alkalmazhatók toxikológiai vizsgálatokban és a jövőben a sejtalapú terápiák sejtforrásául szolgálhatnak. Segítségükkel nem csak az egészséges sejtek fiziológiáját lehet kutatni, hanem ha az őssejtvonalak létrehozásához betegből származó sejteket használunk, akkor számos betegség is vizsgálhatóvá válik, elsősorban azokon a területeken, ahol az állatmodellek, a rákos sejtvonalak illetve a betegből származó primer sejttenyészetek vizsgálata nem hozott áttörést. Jelen pályázatban egy komplex betegség (DiGeorge szindróma) sejtes modelljét hozzuk létre, amely egy kromoszóma sérülés következtében alakul ki, és több szervet is érint. A kiválasztott betegek és egészséges kontroll vérsejtjeit visszaprogramozzuk pluripotens állapotba, majd olyan sejttípusokat hozunk létre, amelyek a betegségben is sérülnek (jelen esetben érképző, és szívizomsejteket). A betegből származó és a kontroll sejteken vizsgáljuk a különbségeket, a sejtérés és a sejtek működése szempontjából. A megfigyelt különbségek alapján következtetünk a betegség kialakulásának sejtszintű mechanizmusaira, amely elengedhetetlen a jövőbeli diagnosztikai/terápiás fejlesztésekhez. Jelenleg a világon csak nagyon kevés humán modell létezik az ilyen komplex betegségek kutatására, így a létrehozott modell mintaként is szolgálhat a későbbi kutatásokhoz.
| Summary Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
Understanding disease mechanisms is a prerequisite for the development of tailored therapies, while in many cases no proper animal or in vitro models are available. In disorders with complex developmental and functional alterations the use of induced pluripotent stem cells (iPSC) may promote a better understanding of the underlying mechanisms. In this project we plan to generate hiPSCs from blood cells of patients suffering from a complex chromosomal deletion, the DiGeorge syndrome (as well as those of healthy relatives as controls), and perform directed differentiation to generate cell types with putative roles in the disease, including endothelial cells and cardiomyocytes. We hypothesize that differences in the in vitro phenotypic profiles of the diseased and control hiPSCs, progenitors and differentiated tissues, may reflect alterations seen in the patients. We will study if differences can be detected in new vessel formation or alterations in calcium homeostasis in the disease affected cells, and if pharmacological modulation of the hiPSC-derived cells can lead to correction of the phenotype. The patients show significant differences in the manifestation of the syndrome, therefore we will also study correlations between the severity of the disease, the genetic background and the in vitro phenotype. We plan to generate normal hiPSCs modified by CRISPR-Cas9 genome editing to selectively delete the DGCR8 gene, affected in this syndrome, and functioning as a key regulator of microRNA processing. These studies may provide important information regarding signalling regulation in stem cell differentiation and the development of the disease.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
Human pluripotent stem cell-based disease modelling is based on the technology that patient-derived somatic cells can be reprogrammed into a pluripotent state (hiPSC) by using master transcription factors. These stem cells can be differentiated into the cells of interest in various diseases. Our project aims to investigate whether this approach may be suitable to understand complex disorders. We will focus on the multiorgan developmental disease, the DiGeorge syndrome, in which our current understanding is strongly limited. Our aim is to generate and study cell types (i.e. endothelial cells and cardiomyocytes) affected in this syndrome. We plan to explore A/ how differences in gene and protein profiles, as well as the function of the affected and control cells reflect changes seen in the patients; B/ How the in vitro pharmacological targeting of the cells affects the disease phenotype. For this purpose, given the multicellular nature of the DiGeorge syndrome, we will build 3D co-cultures (endothelial cells + cardiomyocytes) to test cell-cell interactions. Finally, our aim is to address how DGCR8, one of the critical genes deleted in this syndrome, modulates cell differentiation. The CRISPR-Cas9 genome editing technology will be used to delete DGCR8, which encodes the microprocessor complex mediating the biogenesis of microRNAs, in a normal, control iPS cell line. Lack of DGCR8 would provide new insight how disrupted microRNA signalling may be involved in cell differentiation alterations, observed in the DiGeorge syndrome.
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
Stem cell-based platforms are widely used to study monogenic disorders. These models serve in describing particular disease-related phenotypes and can also be applied to test cellular responsiveness to clinically applicable drugs in cell cultures. However, a major hurdle is to study complex diseases where phenotypes are affected by multiple genes, environmental interactions, involvement of more than one organ, or dysfunctional inaccessible cell types. The DiGeorge syndrome is a microdeletion syndrome; deletion of multiple genes lead, amongst others, to congenital heart disease and neuronal disorders. These conditions may also appear as in vitro phenotypes. Animal models of DiGeorge syndrome have been developed, however, their human-related use is limited by the lack of psychiatric elements and species differences at a cellular level. An earlier study reported the generation of a hiPSC line on a DiGeorge syndrome background included only neuronal differentiation. In our study we enrol a family in which the grandfather‘s and the mother’s clinical manifestation is moderate, and the child has severe malformations. This allows us to investigate the links between disease severity, signalling mechanisms and genotype-phenotype relations in affected cell types. Inclusion of the grandmother and the father, as a healthy control, further helps to identify phenotypic differences in healthy and diseased cases. This study should lead to a better understanding of the disease and the development of diagnostic/therapeutic approaches. It is a great advantage that this project will be performed as a collaborative effort of clinical/stem cell experts at the clinics of Semmelweis University and at the Hungarian Academy of Sciences. Earlier studies focused on mRNA or protein based differences when describing hiPSC disease models. To go beyond this scope, we will also perform functional experiments (Ca-signalling, tube formation analysis, 3D co-culture studies) which are already established by the applicants and can help to reveal the mechanism of the disease. The in vitro model systems (DiGeorge and DGCR8-deficient hiPSC lines) generated in this project will form the basis of further pathological and pharmacological studies.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
Human pluripotent stem cells can be grown indefinitely in laboratories and, under certain cell culture conditions, these cells give rise to selected cell types of our body. These two characteristics provide an excellent model to address question in developmental biology and the cells can also be used as test systems in toxicology studies, and even for cell therapy products. In addition to healthy cell lines, there is an opportunity to generate cell lines from a patient with a particular disease. This allows us to study human diseases in which animal models, cancer cells or primary cell cultures from patients may not provide appropriate information. Our main aim in this project is to create a cellular model of a complex disease, DiGeorge syndrome, which is a consequence of chromosomal microdeletion and affects multiple organs. Blood cells obtained from DiGeorge patients and healthy control subjects will be reprogrammed. Stem cells will be treated to generate cells involved in the syndrome (endothelial cells and cardiomyocytes). We will compare healthy and diseased cells regarding their differentiation and function. The obtained differences will lead us to a better understanding of the underlying disease mechanisms, which is of utmost importance for future development of diagnostic tools and therapeutic approaches. Currently only a limited number of human models are available to investigate complex disorders, therefore our project may provide a useful example for future studies in this field.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
