Novel synthetic biology methods for symbiotic bacteria to identify and characterize genes required for the infection and invasion of the nitrogen-fixing nodule
Új szintetikus biológiai módszerek szimbiotikus baktériumok számára a nitrogénkötő gümő fertőzésében és inváziójában szerepet játszó gének azonosítására és jellemzésére
Title in English
Novel synthetic biology methods for symbiotic bacteria to identify and characterize genes required for the infection and invasion of the nitrogen-fixing nodule
Keywords in Hungarian
szimbiotikus nitrogénkötés, rhizóbium mutáns, genom szerkesztés, szabályozott génkifejeződés
Interspecific interactions (Council of Complex Environmental Sciences)
65 %
Molecular genetics, reverse genetics and RNAi (Council of Medical and Biological Sciences)
25 %
Ortelius classification: Molecular genetics
Microbiology: virology, bacteriology, parasitology, mycology (Council of Medical and Biological Sciences)
10 %
Ortelius classification: Bacteriology
Panel
Genetics, Genomics, Bioinformatics and Systems Biology
Department or equivalent
Institute of Plant Biology (HUN-REN Biological Research Centre Szeged)
Participants
BALLA, Benedikta GÜNGÖR, Berivan Kovács, Szilárd Nagy, István WANG, Ting
Starting date
2018-12-01
Closing date
2023-11-30
Funding (in million HUF)
47.999
FTE (full time equivalent)
6.80
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. A javasolt projekt célja olyan szintetikus biológiai eszköztár létrehozása és adaptálása rhizobium baktériumok számára, melyek segítségével a szimbiotikus gyökérgümő fejlődése során a baktériumokat az új szerv belseje felé szállító infekciós fonal kialakulásában és növekedésében szerepet játszó gének funkciója vizsgálható. Az eszköztár használatával azon gének későbbi lépésekben betöltött funkciója is tanulmányozható, melyek hibája a folyamatot az első lépésekben állítja le, így mutánsok használatával hozzájárulásuk a folyamathoz nem vizsgálható. Emellett transzkripciós szinten vizsgálni fogjuk a vad típusú illetve receptor génekben hibás gazdanövények reakcióit olyan mutáns baktériumokra, melyek pl. sejtfelszíni poliszaharidok hiánya vagy módosult termelése miatt nem képesek az infekciós fonal iniciálására vagy növekedésének fenntartására.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. A nitrogénkötő szimbiotikus gümő fejlődésének egyik meghatározó lépése a baktériumokat a fejlődő gümő sejtjei felé szállító infekciós fonal kialakulása illetve növekedésének fenntartása. E folyamatokról sokkal több információ áll rendelkezésünkre a növényi partner oldaláról, míg a baktérium szimbionta ehhez szükséges génjeiről sokkal kevesebbet tudunk. Ismert, hogy a sejtfelszíni poliszaharidokat nem vagy hibás szerkezettel termelő baktériumok nem tudják inicializálni az infekciós fonal létrejöttét. Hasonlóképp, a Nod faktorok érzékelését és a szignál transzdukcióját végző fehérjék, s ebből következően a szignál molekula maga is, szükségesek az infekciós folyamathoz. A projekt során arra keressük a választ, hogy az ismert, a Nod faktor termeléséért illetve az exopoliszaharidok szintéziséért felelős nod és exo gének működése az infekciós folyamat mely fázisáig szükséges. A kérdés megválaszolásához pedig egy szintetikus biológiai eszköztárat hozunk létre rhizobium baktériumok számára. Emellett meglévő mutánsok segítségével azonosítani akarunk új, a folyamatban szerepet játszó géneket, melyek az infekciós fonal kialakulásához és fejlődéséhez szükséges további aktiviásokat/funkciókat határoznak meg. Végezetül kíváncsiak vagyunk arra, hogy a vad típusú illetve receptor génekben hibás gazdanövények miképp reagálnak olyan mutáns baktériumokra, melyek pl. sejtfelszíni poliszaharidok hiánya vagy módosult termelése miatt nem képesek az infekciós fonal iniciálására vagy növekedésének fenntartására.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! A szimbiotikus nitrogénkötés alapvető fontosságú a földi nitrogén körforgásban és jelentős szerepet játszik a fenntartható mezőgazdasági termelésben. Viszonylag sokat tudunk a szimbiotikus szerv, a nitrogénkötő gyökérgümő kialakulásának és működésének kezdeti és végső lépéseiről, míg jóval kevesebb információnk van egy köztes lépésről, a szimbiotikus baktériumokat az új szerv belseje felé szállító infekciós fonal kialakulásáról és növekedéséről, az e folyamatokhoz szükséges bakteriális génekről/funkciókról, illetve a nem megfelelő baktériumokra adott növényi válaszreakciókról. A tervezett kutatás ezt a hiányt próbálja részben orvosolni új bakteriális gének izolálásával, ismert gének későbbi szerepének feltárásával illetve vad típusú illetve receptor génekben hibás gazdanövények válaszreakcióinak olyan mutáns baktériumokra adott válaszreakcióinak vizsgálatával, melyek pl. sejtfelszíni poliszaharidok hiánya vagy módosult termelése miatt nem képesek az infekciós fonal iniciálására vagy növekedésének fenntartására.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. A pillangósvirágú növények szimbiózist alakítanak ki a talajlakó rhizobium baktériumokkal a célból, hogy azok redukálják a levegő nitrogénjét ammóniává, amit már a növény is tud hasznosítani. A baktériumok egy új növényi szerv, a gyökérgümő sejtjeiben végzik a nitrogén redukcióját, ahova egy infekciós fonalnak nevezett csőszerű struktúrán keresztül jutnak be. Most még kevésbé ismert, hogy milyen baktérium gének, funkciók irányítják az infekciós fonal növekedését. Célunk, hogy új ismereteket szerezzünk a folyamat hátteréről.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. The aim of the proposed project is the development and adaptation of synthetic biology tools for rhizobia that can be used for the investigation of the function of bacterial genes required for the growth of infection threads that take bacteria into the cells of the developing symbiotic nodule, a de novo formed organ to host symbionts. The tool kit will allow to study the role of those genes during infection thread growth that are essential for the infection thread initiation, i.e. their mutations prevent the initiation step. In addition, we will investigate the transcriptomic responses wild type or receptor mutant plants towards bacteria that, for example, cannot maintain infection thread growth because they produce no or structurally modified surface polyasaccharides.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. One of the essential steps during the development of the nitrogen-fixing symbiotic root nodule is the initiation and growth of the infection threads that take bacteria to the cells of the developing nodule. There are a lot more information available about the genetic background of the process in the plant partner than in the bacterial symbiont. It is already known that bacteria producing no or structurally modified exopolysaccharide cannot initiate infection thread development. Similarly, the recognition and perception of Nod factors by the plant, and as a consequence, the Nod factors themselves are also required for the infection process. During the proposed project we try to answer the question how long the functioning of the production of Nod factors and exopolysaccharides know to be essential for the initiation of infection threads is required during the growth of infection threads. To answer this question, a synthetic biology tool kit will be developed for rhizobia. In addition, novel genes/functions required for the infection thread initiation and development will be identified with help of available mutants. Finally, we are interested in the response reactions of wild type or receptor mutant plants towards bacteria that, for example, cannot maintain infection thread growth because they produce no or structurally modified surface polyasaccharides.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. Symbiotic nitrogen fixation is essential in the global nitrogen cycle and plays an important role in the sustainable agriculture. There are a lot of knowledge available about the first and final steps of the symbiotic nodule development and functioning, however, there is much less information regarding an intermediate developmental step, the initiation and growth of infection threads that lead bacteria towards and into the cells of the developing nodule, about the bacterial genetic background of these processes as well as about the plant reactions to bacteria that are defective in the infection thread development. The proposed project aims to (partly) stop this gap via the isolation of novel baterial genes required for infection thread development, by revealing the function in infection thread growth of genes essential for infection thread development, or by studying the response reactions of wild type or receptor mutant plants towards bacteria that, for example, cannot maintain infection thread growth because they produce no or structurally modified surface polyasaccharides.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. Leguminous plants establish symbiosis with soil bacteria termed rhizobia in order to make bacteria to reduce atmospheric nitrogen into ammonia that can be utilized by the plant. Bacteria reduce nitrogen in the cells of a novel plant organ called nodule to where they reach via a tubular structure called infection thread. At present, we have very little knowledge about the bacterial genes, functions that direct the growth of the infection thread. The proposed project aim to gain novel insights about the genetic background of this process.
Final report
Results in Hungarian
A legtöbb, E. coli-ra kidolgozott szintetikus biológia eszközt nem lehet hatékonyan használni a gamma-Proteobacterium csoport fajain kívül, ezért egyik célunk az volt, hogy ilyen eszközöket fejlesszünk és adaptáljunk a rhizobiumok számára. Az ezen eszközök használata során szükséges nagyszámú, több fragment egymáshoz kapcsolását magába foglaló klónozás elősegítésére kidolgoztunk egy költséghatékony, egyszerűsített GoldenGate klónozási rendszert. A rhizobiumok nagyon alacsony transzformációs kompetenciája nem teszi lehetővé a pont-/frameshift mutációk indukálására kifejlesztett pORTMAGE rendszer használatát, ezért kifejlesztettünk egy retron-alapú rendszert, mellyel a mutagén oligonukleotidokat a sejtben termeltetjük. A rhizobium gének kifejeződésének tetszés szerinti manipulálására két megközelítést, egy guideRNS-deadCAS9 alapú és egy operátor-transzkripciós faktor alapú gén csendesítési módszert hoztunk létre. A rhizobiumok fehérje-fehérje kölcsönhatásainak tanulmányozásához a Sinorhizobium meliloti 1021 törzs összes ORF-jét hordozó élesztő és bakteriális kettős hibrid könyvtárakat hoztunk létre és teszteltünk.
A sejtfelszíni poliszaharidok valamint sejtfelszíni receptorok bakteriális invázióban betöltött szerepének vizsgálatára az exopoliszaharidjukban különböző strukturális módosításokkal rendelkező mutánsokat állítottunk elő és teszteltünk számos Medicago ökotípuson. Megkezdtük annak a genetikai lókusznak a térképezését, ami megengedi, hogy a KPS helyettesítse az EPS-t.
Results in English
As most synthetic biology toolkits developed for the model organism E. coli cannot be effectively used outside and often within the group of gamma-Proteobacteria, one aim of the project was to develop and adapt synthetic biology tools for rhizobia to manipulate their gene expression and the activity of their proteins. To facilitate the cloning works associated with these tools we developed a cost-effective, simplified GoldenGate cloning system to assemble multiple fragments. As the very low transformation competence in rhizobia does not allow the efficient use of the pORTMAGE method to induce point and frameshift mutations, a binary retron-based system was deviced that produces the mutagenic oligonucleotides in the cell. To manipulate the expression of the rhizobial genes at will even in the nodules, two approaches, a guideRNA-deadCAS9 based and an operator-transcription factor based silencing methods were established. To investigate the protein-protein interactions of rhizobia, yeast and bacterial two-hybrid libraries containing all predicted ORFs of Sinorhizobium meliloti strain 1021 were created and tested.
To investigate the role of surface polysaccharides and plant surface receptors in the bacterial infection process, bacterial mutants producing exopolysaccharides with different structural defects were created and tested a number of Medicago ecotypes. The genetic mapping of a genetic trait allowing capsular polysaccharides acting in the place of EPS has been initiated.
