Novel synthetic biology methods for symbiotic bacteria to identify and characterize genes required for the infection and invasion of the nitrogen-fixing nodule
Új szintetikus biológiai módszerek szimbiotikus baktériumok számára a nitrogénkötő gümő fertőzésében és inváziójában szerepet játszó gének azonosítására és jellemzésére
Title in English
Novel synthetic biology methods for symbiotic bacteria to identify and characterize genes required for the infection and invasion of the nitrogen-fixing nodule
Keywords in Hungarian
szimbiotikus nitrogénkötés, rhizóbium mutáns, genom szerkesztés, szabályozott génkifejeződés
Interspecific interactions (Council of Complex Environmental Sciences)
65 %
Molecular genetics, reverse genetics and RNAi (Council of Medical and Biological Sciences)
25 %
Ortelius classification: Molecular genetics
Microbiology: virology, bacteriology, parasitology, mycology (Council of Medical and Biological Sciences)
10 %
Ortelius classification: Bacteriology
Panel
Genetics, Genomics, Bioinformatics and Systems Biology
Department or equivalent
Institute of Plant Biology (HUN-REN Biological Research Centre Szeged)
Participants
BALLA, Benedikta GÜNGÖR, Berivan Kovács, Szilárd Nagy, István WANG, Ting
Starting date
2018-12-01
Closing date
2023-11-30
Funding (in million HUF)
47.999
FTE (full time equivalent)
6.80
state
running project
Final report
Results in Hungarian
A legtöbb, E. coli-ra kidolgozott szintetikus biológia eszközt nem lehet hatékonyan használni a gamma-Proteobacterium csoport fajain kívül, ezért egyik célunk az volt, hogy ilyen eszközöket fejlesszünk és adaptáljunk a rhizobiumok számára. Az ezen eszközök használata során szükséges nagyszámú, több fragment egymáshoz kapcsolását magába foglaló klónozás elősegítésére kidolgoztunk egy költséghatékony, egyszerűsített GoldenGate klónozási rendszert. A rhizobiumok nagyon alacsony transzformációs kompetenciája nem teszi lehetővé a pont-/frameshift mutációk indukálására kifejlesztett pORTMAGE rendszer használatát, ezért kifejlesztettünk egy retron-alapú rendszert, mellyel a mutagén oligonukleotidokat a sejtben termeltetjük. A rhizobium gének kifejeződésének tetszés szerinti manipulálására két megközelítést, egy guideRNS-deadCAS9 alapú és egy operátor-transzkripciós faktor alapú gén csendesítési módszert hoztunk létre. A rhizobiumok fehérje-fehérje kölcsönhatásainak tanulmányozásához a Sinorhizobium meliloti 1021 törzs összes ORF-jét hordozó élesztő és bakteriális kettős hibrid könyvtárakat hoztunk létre és teszteltünk.
A sejtfelszíni poliszaharidok valamint sejtfelszíni receptorok bakteriális invázióban betöltött szerepének vizsgálatára az exopoliszaharidjukban különböző strukturális módosításokkal rendelkező mutánsokat állítottunk elő és teszteltünk számos Medicago ökotípuson. Megkezdtük annak a genetikai lókusznak a térképezését, ami megengedi, hogy a KPS helyettesítse az EPS-t.
Results in English
As most synthetic biology toolkits developed for the model organism E. coli cannot be effectively used outside and often within the group of gamma-Proteobacteria, one aim of the project was to develop and adapt synthetic biology tools for rhizobia to manipulate their gene expression and the activity of their proteins. To facilitate the cloning works associated with these tools we developed a cost-effective, simplified GoldenGate cloning system to assemble multiple fragments. As the very low transformation competence in rhizobia does not allow the efficient use of the pORTMAGE method to induce point and frameshift mutations, a binary retron-based system was deviced that produces the mutagenic oligonucleotides in the cell. To manipulate the expression of the rhizobial genes at will even in the nodules, two approaches, a guideRNA-deadCAS9 based and an operator-transcription factor based silencing methods were established. To investigate the protein-protein interactions of rhizobia, yeast and bacterial two-hybrid libraries containing all predicted ORFs of Sinorhizobium meliloti strain 1021 were created and tested.
To investigate the role of surface polysaccharides and plant surface receptors in the bacterial infection process, bacterial mutants producing exopolysaccharides with different structural defects were created and tested a number of Medicago ecotypes. The genetic mapping of a genetic trait allowing capsular polysaccharides acting in the place of EPS has been initiated.
