Investigation of heat stress linked RNAi and crop quality determining genes by genome editing technology in barley.
Keywords in Hungarian
árpa, CRISPR, RNSi, hő stressz, termés minőség
Keywords in English
barley, CRISPR, RNAi, heat stress, crop quality
Discipline
Plant stress biology (Council of Complex Environmental Sciences)
50 %
Plant biotechnology (Council of Complex Environmental Sciences)
50 %
Panel
Complex agricultural sciences
Department or equivalent
Genetika és Biotechnológia Intézet (MATE) (Hungarian University of Agriculture and Life Sciences)
Participants
Dalmadi, Ágnes Kis, András
Starting date
2018-12-01
Closing date
2021-08-31
Funding (in million HUF)
19.980
FTE (full time equivalent)
1.65
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. A genomszerkesztési technológiák hatékony felhasználása irányított mutagenezis létrehozására az utóbbi idők egyik legnagyobb molekuláris biológiai áttörése. Laboratóriumunkban kísérleteket végzünk több területen is az árpa genomszerkesztés megalapozására, amelyeket szeretnénk kiterjeszteni. Összehasonlító bioinformatikai analízissel azonosítjuk a feltételezett árpa RNS interferencia faktorokat, különös tekintettel DCL, AGO és RDR családokba tartozó komponensekre. Vad típusú árpa növények hő stressz kezelését követő gén expressziós analízissel azonosítani tervezzük azokat az árpa RNS interferencia faktorokat, amelyek fontos szerepet játszhatnak a hő stressz adaptációban. Az azonosított géneket genomszerkesztési eljárással kiütjük is szerepüket a hő stressz válaszban molekuláris biológiai eszközökkel vizsgáljuk. A genomszerkesztési eljárást fel szeretnék használni a szemtermés mennyiségének javítására is a SIX-ROWED SPIKE (VRS) gén tervszerű inaktiválásával. A cél gén inaktiválása az oldal kalászkák szem terméseinek nagyobb méretét és egyenletesebb méret elosztását eredményezhetik. A kísérleteink megbízhatóságának növelése érdekében, a közölt Cas9 funkcionális adatok alapján, tervezzük egy kiemelkedő pontosságú módosított növény specifikus Cas9 konstrukció létrehozását.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. A tervezett kísérletek segíthetnek megérteni az árpa hő stressz adaptációját, amely fontos kutatási terület különösen a klímaváltozás tükrében. A cél elérésének érdekében vad típusú árpa növények hő stressz kezelését követő gén expressziós analízissel azonosítani tervezzük azokat az árpa RNS interferencia faktorokat, amelyek fontos szerepet játszhatnak a hő stressz adaptációban. Az azonosított géneket genomszerkesztési eljárással kiütjük is szerepüket a hő stressz válaszban molekuláris biológiai eszközökkel vizsgáljuk. A genomszerkesztési eljárást rutinszerű eljárássá szeretnénk fejleszteni laboratóriumunkban így fel szeretnék használni a szemtermés mennyiségének javítására is a SIX-ROWED SPIKE (VRS) gén tervszerű inaktiválásával. A cél gén inaktiválása az oldal kalászkák szem terméseinek nagyobb méretét és egyenletesebb méret elosztását eredményezhetik. A genom szerkesztés rutin felhasználásának megteremtésének érdekében tervezzük egy kiemelkedő pontosságú módosított növény specifikus Cas9 konstrukció létrehozását is.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! A kísérleteink fontosak abból a szempontból, hogy a modell szervezetek vizsgálatával szerzett ismereteinket felhasználjuk gazdaságilag fontos növények esetében is. Így az RNS interferencia faktorok szerepének vizsgálata árpában fontos terület alapkutatási, de hosszabb távon alkalmazott területen is. Eredményeink modell szervezettekkel való összehasonlítása segítheti a komplex hő stressz adaptáció megértését. Technológia megközelítésként a genom szerkesztés rutinszerű, megbízható alkalmazása az előfeltétele a sikeres irányított mutagenzis kísérleteknek. A genomszerkesztés hatékony használata lehetővé teheti alkalmazott irányultságú kísérletek elvégzését is, amelyek hosszabb távon segítheti akár a nemesítők munkáját is.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. A genom szerkesztés egy rendkívül hatékony molekuláris biológiai eljárás, amely lehetővé teszi mutációk nagy pontosságú bevezetését bármely élőlény, így a növények, genomjába. Amennyiben birtokába kerülünk egy nagy pontosságú genomszerkesztési eljárásnak és rutinszerűen tudjuk alkalmazni cél gének mutációs vizsgálatára akkor lehetőségünk nyílik komplex folyamatok biológiai hátteret vizsgálni nem csak modell növényekben, hanem gazdaságilag fontos fajokban is. Kísérleteink célja, hogy precíz genom szerkesztési eljárással bevezetett mutációkkal vizsgáljuk az árpa hő stressz érzékelésben szerepet játszó, a kis RNS szabályozási útvonal fő szereplőit, kódoló gének szerepét. Továbbá a genom szerkesztési eljárást szeretnénk felhasználni olyan gazdaságilag fontos tulajdonságokat meghatározó gének mutációs analízisére, amely a termés mennyiségét a termés magszámán keresztül határozhatják meg.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. The utilization of genome editing technologies for efficient generation of site directed mutagenesis is a major advance in recent history of molecular biology. We are carrying out experiments for establishing barley genome editing in our laboratory and we would like to extend these experiments. By comparative bioinformatics approaches we will identify barley RNA interference factors, focusing mainly on DCL, AGO and RDR genes. We will identify heat stress related RNA interference factors by targeted gene expression analyses of heat stress treated wild type barley plants. The identified genes will be mutated by genome editing and mutant plants will be investigated under stress conditions to reveal the role of candidate genes in stress response. The genome editing technologies will also be used for coordinated knock-out SIX-ROWED SPIKE (VRS) gene. These mutation may result in increased lateral grain size and greater grain uniformity. To enhance the reliability of our experiments we plan, based on published functional studies of Cas9, to elaborate a high fidelity modified plant specific Cas9 construct.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. The planned experiments will help to understand the molecular mechanism lying behind the heat stress adaption of barley. This scientific goal represent important scientific field especially in the mirror of global warming. To achieve this goal we will identify heat stress related RNA interference factors by targeted gene expression analyses of heat stress treated wild type barley plants. The identified genes will be mutated by genome editing and mutant plants will be investigated under stress conditions to reveal the role of candidate genes in stress response. We would like to establish the routine usage of genome editing in our laboratory. To achieve this goal it will also be used for engineered knock-out SIX-ROWED SPIKE (VRS) gen. This mutation may result in increased lateral grain size and greater grain uniformity. To establish the genome editing technology as routine method we would like to elaborate a high fidelity modified plant specific Cas9 construct.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. Our experiments are representing an important filled by connecting the basic knowledge obtained by the investigation of model organism to economically important crops. Thus, the investigation of RNA interference factors in heat stress adaptation of barley is an important field in respect of basic and applied sciences. The comparison of our results with data gained from model organisms will help to understand the complex molecular mechanism of heat stress adaptation in plants. From technological point of view the reliable and efficient utilization of genome editing is the fundament of site directed mutagenesis experiments. The usage of efficient genome editing technology allows the establishment of applied experiments providing plant materials suitable for breeders to enhance crop traits.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. Genome editing is a powerful molecular biology technology introducing site specific mutations into the genome of plants, animals and microbes. The successful routine utilization of genome editing in the laboratory allows the precise investigation of target genes providing an efficient tool to understand complex biological processes, not only model plants but also in important crop species. Our aim is to investigate the major genes involved in small RNA mediated regulation in heat stress adaption of barley by introducing precise mutations by genome editing into target genes. Moreover we would like to use this technology to mutate barley gene controlling seed number potentially enhancing the production rate of important barley cultivars.
Final report
Results in Hungarian
Az RNS interferencia fő komponensei a Dicer (DCL), Argonaute (AGO) és RNS-függő RNS-polimeráz (RDR) fehérjék. A pályázat végrehajtása során in silico eljárással azonosítottunk öt hvDCL, 11 hvAGO és hét hvRDR fehérjét az árpa genomban. Elvégeztük az azonosított fehérjék/gének genom lokalizációját és filogenetikai analízisét, a fehérjék doménszerkezetének és funkcionális motívumainak meghatározást. Az RNS interferencia komponensek expressziójának változásait hő stressz kezelés hatásra szintén vizsgáltuk. Az eredményeink az mutatták, hogy az RNS interferencia a hő stressz érzékekés és szabályozás fontos eleme lehet árpában. További kísérleteinkben, a CRISPR/Cas9 genom szerkesztés eljárást felhasználva, mutáns árpa vonalakat hoztunk létre, amelyek alkalmasak lehetnek az RNS interferencia faktorok (DCL3, AGO6) illetve a termés mennyiségét és a kalász szerkezetét befolyásoló gének (GW2, VSR1) vizsgálatára. A jelenlegi munkánk során létrehozott árpa vonalak lehetővé teszik a felsorolt jelenségek mélyebb analízisét a jövőben.
Results in English
The key components of RNA silencing are the Dicer-like proteins (DCLs), Argonautes (AGOs) and RNA-dependent RNA polymerases (RDR). In this work, we in silico identified five DCL (HvDCL), eleven AGO (HvAGO) and seven RDR (HvRDR) genes in the barley genome. Genomic localization, phylogenetic analysis, domain organization and functional/catalytic motif identification were also performed. To understand the regulation of RNA silencing, we experimentally analyzed the transcriptional changes in response to heat stress treatment. The results suggest that RNA silencing is dynamically regulated and may be involved in the coordination of development and environmental adaptation in barley. Moreover, utilizing CRISPR/Cas9 mediated genome editing we have established several mutant barley lines, suitable for detailed investigation of RNA interference components (DCL3, AGO6) and barley genes (GW2, VRS1) involved in the development of seeds or determining the structure of spike. This recent work provides stable transgenic lines for the detailed investigation of barley RNA silencing and developmental components in the future.
Hamar E., Szaker H.M., Kis A., Dalmadi A., Miloro F., Szittya G., Taller J., Gyula P., Csorba T., Havelda Z.: Genome-wide identification of RNA silencing-related genes and their expressional analysis in response to heat stress in barley (Hordeum vulgare L.)., Biomolecules 10, 929; doi:10.3390/biom10060929, 2020
Hamar E., Szaker H.M., Kis A., Dalmadi A., Miloro F., Szittya G., Taller J., Gyula P., Csorba T., Havelda Z.: Genome-wide identification of RNA silencing-related genes and their expressional analysis in response to heat stress in barley (Hordeum vulgare L.)., Biomolecules 10, 929; doi:10.3390/biom10060929, 2020
