 |
DEVELOPMENT OF SPONTANEOUSLY BLINKING DNA-PAINT PLATFORMS FOR SUPERRESOLUTION MICROSCOPY IN LIVE CELLS
|
Help 
Print 
|
Here you can view and search the projects funded by NKFI since 2004
Back »
|
| |
Details of project |
|
|
| Identifier |
131439 |
| Type |
K |
| Principal investigator |
Kele, Péter |
| Title in Hungarian |
Szuperfelbontású mikroszkópiára alkalmas, spontán villogó DNS-PAINT rendszerek fejlesztése |
| Title in English |
DEVELOPMENT OF SPONTANEOUSLY BLINKING DNA-PAINT PLATFORMS FOR SUPERRESOLUTION MICROSCOPY IN LIVE CELLS |
| Keywords in Hungarian |
DNS, PAINT, Klikk-kémia, fluorogén, szuperfelbontású mikroszkópia |
| Keywords in English |
DNA, PAINT, Click chemistry, fluorogenic, superresolution |
| Discipline |
| Organic, Biomolecular, and Pharmaceutical Chemistry (Council of Physical Sciences) | 70 % | | Ortelius classification: Intelligent materials | | Biological Applications of Chemistry (Council of Physical Sciences) | 30 % |
|
| Panel |
Chemistry 2 |
| Department or equivalent |
Institute of Organic Chemistry (Research Center of Natural Sciences) |
| Participants |
Németh, Krisztina
Pünkösti, Zoltán
Söveges, Bianka
Szatmári, Ágnes
|
| Starting date |
2019-12-01 |
| Closing date |
2022-11-30 |
| Funding (in million HUF) |
31.262 |
| FTE (full time equivalent) |
9.83 |
| state |
closed project |
Summary in Hungarian A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
A fluoreszcens markerek lokalizációján alapuló szuperfelbontású mikroszkópos eljárások során kisszámú fénypont véletlenszerű felvillanására van szükség. Többféle, külső beavatkozást alkalmazó eljárás létezik ilyen villogás előidézésére. E módszerek egyrészt erősen leszűkítik az alkalmazható markerek számát, másrészt erősen korlátozzák a lokalizációs módszerek élő sejtekben való alkalmazhatóságát. A DNS-PAINT technika sok szempontból jelentett áttörést a szuperfelbontású mikroszkópiában. A módszer egy jelölt DNS szál és egy nem jelölt, a vizsgálni kívánt biomolekulához konjugált DNS szál átmeneti hibridizációja során megváltozó fotofizikai tulajdonságok detektálásán alapul. A módszer számos előnnyel rendelkezik más lokalizációs módszerekhez képest, pl. no-bleaching, ám kizárólag fixált sejtek vizsgálatát teszi lehetővé. Ráadásul speciális technikák kellenek a háttérjel csökkentésére. A javasolt megközelítések e hatékony technika kiterjesztését tűzi ki célul, élő sejtekre. Mindkét megközelítés biokompatibilis klikk-reakcióval köti a dokkoló-szálat a biomolekulához. Az első módszer esetében ez a szál vagy FRET-akceptorral jelölt és képes egy donorral jelölt komplementer szál megkötésére, vagy egyidejűleg képes megkötni egy-egy donorral/akceptorral jelölt szálat. A FRET detektálása miatt nincs szükség a háttér kiküszöbölésére. A másik módszernél a biomolekulához klikkelt dokkoló-szál egy interkalátor festékkel módosított DNS/PNS szálat képes megkötni, így a hibridizáció jelentős fluoreszcencia növekedéssel jár. A hibridizáló szálakat úgy választjuk meg, hogy azok olvadáspontja 20-25 °C körül legyen, amitől egy eddig nem leírt, hőre érzékeny spontán villogó rendszert remélünk.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
A kutatás alapkérdése, hogy lehetséges-e a DNS-PAINT technika kiterjesztése élő sejtek vizsgálatára. Ahhoz, hogy ezt eldönthessük, egy sor kérdésre kell választ adnunk a kísérletek során. A következő kérdéseket kell megválaszolnunk i) melyik szálat jelöljük a FRET donorral és melyiket az akceptoral?; ii) melyik megközelítés (két vagy három DNS szálat használó) megközelítés eredményez alacsonyabb háttérfluoreszcenciát, úgy, hogy közben megtartjuk a DNS-PAINT technika előnyös tulajdonságait (pl. fotobleaching mentes képalkotás); iii) a bioortogonálisan konjugáható DNS szálak membránpermeábilisak-e vagy további módosítóelemeket kell alkalmaznunk (pl. sejtpenetráló peptidek); iv) a DNS/PNS szálak mely pozíciójába célszerű bevinni az interkalátor feséket, hogy maximális intenzitásnövekedést érjünk el és megtartsuk a hibridizáció specificitását?; v) van az interkalátorral módosított egyszálú DNS/PNS szálaknak háttérfluoreszcenciája? milyen mértékű háttérfluoreszcencia jelent gondot? mekkora intenzitás-növekedés kell a hibridizáció során, hogy ezt ellensúlyozza; vi) melyik interkalátor festék a legjobb fotostabilitás és az intenzitásnövekedés szempontjából?; vii) tudunk-e spontán villogást előidézni olyan DNS/PNS szálakkal, melyek olvadáspontja szobahőmérséklet közeli? Tudjuk-e ezt úgy szabályozni, hogy az lehetővé tegye a lokalizálást; vii) a két megközelítés közül melyik teszi lehetővé általános eljárás kidolgozását, többszínű jelölést?
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
A pályázatban megfogalmazott tervek nagyobb ívű, nehezebben megvalósítható célokat is megfogalmaznak, mint amilyen a hőmérséklet hatására bekövetkező villogás. E nehezebben elérhető, de nagyon ígéretes célok viszont minden bizonnyal forradalmi jelentőségűek a szuperfelbontású mikroszkópia szempontjából. Míg e nagyobb ívű tervek magukban hordozzák kiváló metodikai és diagnosztikai fejlesztések lehetőségét, a pályázat részét képezik könnyebben megvalósítható célok is. A kutatócsoport tevékenysége nemzetközileg elismert a bioortogonális klikk-kémia, a fluoreszcens/fluorogén markerek fejlesztése és biomolekulák fluoreszcens technikákkal történő képalkotása terén elért eredményeinek köszönhetően. Az e területeken megszerzett, több évre visszanyúló tapasztalatok garantálják, hogy a kevésbé nehezen megvalósítható rész-célok teljesüljenek. Ilyen rész-célok például az interkalátor festékekkel módosított PNS és DNS bázisok szintézise, interkalátor festékek felismerésére és alkalmankénti bekapcsolására alkalmas aptamerek kifejlesztése valamint a DNS-PAINT módszer élő sejtekre való alkalmazhatóságának kidolgozása. Ezek az eredmények akár külön-külön is jelentős hozzájárulással bírnak a szuperfelbontású képalkotó technikák illetve a nukleinsav-kémia terén. Eredményeinket magas hatástényezőjű folyóiratokban és nemzetközi, valamint hazai konferenciákon is bemutatjuk. Ezen kívül a projekt kitűnő lehetőséget biztosít fiatal kutatók és diákok számára, hogy új ismeretekre tegyenek szert vagy elmélyítsék meglevő tudásukat a kémiai biológia terén. A pályázatban megfogalmazott tervek elegendő eredménnyel szolgálnak egy doktroandusz hallgatónak disszertációja megírásához vagy egy, a pályázatra alkalmazott posztdoktori munkatársnak, hogy megalapozza tudományos pályafutását. A pályázatban megfogalmazott célok nemzetközileg is nagy jelentőségű eredményekkel kecsegtetnek, ráadásul, tudomásunk szerint az első olyan alapkutatási téma Magyarországon mely a DNS-PAINT technika továbbfejlesztését tűzi ki célul és sikeres megvalósítás esetén akár szabadalmaztatható is.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
A 2014-ben Nobel-díjjal elismert, mikroszkópokkal kapcsolatos fejlesztések mára lehetővé teszik a biomolekuláris folyamatok rutinszerű vizsgálatát olyan mérettartományban is, mely eddig nem volt lehetséges. Ezek az úgynevezett szuperfelbontású mikroszkópos technikák bizonyos markervegyületek által kibocsátott fény észlelésén alapulnak. Bár számos szuperfelbontására alkalmas mikroszkópos technika létezik manapság, mindnek van valamilyen korlátja. Az egyik leggyakrabban alkalmazott módszer a célterületre bevitt markerek véletlenszerű felvillanásán alapszik. E felvillanások előidézése több (fény, kémiai) külső hatásra is előidézhető. Ezek a külső hatások azonban gyakran limitálják az adott módszer alkalmazhatóságát élő szervezetekben. Jelen pályázatban olyan rendszer kidolgozását tűztük ki célul, mely lehetővé teszi egy általánosan alkalmazható, külső hatást nem igénylő spontán villogásra alkalmas rendszer kifejlesztését. Ilyen általánosan alkalmazható eljárás kiváló módszertani és diagnosztikai fejlesztések záloga lehet, melyek hozzájárulhatnak a biológiai folyamatok jobb megértéséhez és ezáltal hatékonyabb gyógyszerek, diagnosztikai eszközök kifejlesztéséhez.
| Summary Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
Super-resolution localization techniques rely on the stochastic appearance of sparse fluorescent signals enabling precise localization of light sources. Such sparse excitation of a small subset of fluorophores is achieved by applying external stimuli. Not only do these activation modes limit the number of probes but also prevent its use from live cells. DNA point accumulation for imaging in nanoscale topography (DNA-PAINT) was a major breakthrough, recently. It relies on detecting changes in photophysical parameters upon transient interaction of a labeled-DNA strand (imager) with a non-labeled, docking strand anchored to a biomolecule. While it offers several advantages over traditional SRM techniques, e.g. no bleaching, wide choice of fluorophores, multicolor-imaging etc. it is limited to fixed cells and requires special setups to eliminate background fluorescence. The two proposed approaches could enable extension of this powerful method to live cell imaging. Both applies biorthogonal click-chemistry to allow live cell anchoring of the docking strands. In the first approach, this strand is either labeled with an FRET acceptor-dye and can bind a donor-dye labeled strand transiently, or can accommodate two, FRET labeled imagers at the same time. Since appearance of the FRET signal is to be detected, there is no need for background elimination. In the other approach, the clicked docking strand can bind an intercalator dye tagged complementary strand leading to remarkable increase of signal. In both case complementary strands are selected so, that their melting points ensure dynamic ON-OFF events, resulting in so far unprecedented, thermo-responsive blinking systems.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
Extension of the DNA-PAINT technique to live-cell labeling is a major challenge that is in the focus of the proposal. In order to address this challenge a systematic study that aims at assessing the possibility of the extension of DNA-PAINT technology to live cells is proposed. To this end, several questions are to be answered through accomplishing the proposed tasks. Such questions are: i) which strand is to be labeled with a FRET donor and acceptor dye; ii) which approach (e.g. two or three strands) allows lower background while maintaining the advantageous features of DNA-PAINT (i.e. no photobleaching); iii) can we introduce bioorthogonally conjugatable docking strands and labeled imager strands into cells or it requires installation of further elements (e.g. cell-penetrating peptides); iv) where to incorporate the intercalator dye into a PNA/DNA strand in order to achieve maximal signal increase with no loss of specificity; v) does the intercalator-bearing single stranded DNA/PNA have background fluorescence? to which extent is it a problem? How much the increase upon annealing should be in order to make up for it?; vi) which intercalator dye is the most suitable in terms of photostability and signal increase; vii) can we induce spontaneous (inherent) blinking by applying DNA/PNA strands with melting point at around room temperature, can it be fine-tuned in order to be suitable for single molecule localization?; vii) of the two methods, which allows more general use and enable multicolor labeling?
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
The proposal certainly involves some more challenging tasks e.g. thermo-responsive inherently blinking systems where successful outcome is not guaranteed. However, such achievements by its general usability and extension to live cell imaging would revolutionize super-resolution microscopy. While such high-risk-high-gain objectives certainly hold out a great promise for excellent methodological and diagnostic improvements, there are several more straightforward aims as well. The research group is internationally renowned in the fields of biorthogonal click-labeling of biomolecules, development of fluorescent/fluorogenic probes and imaging of intracellular structures. Such expertise guarantee that less challenging tasks will be met. In particular, synthesis of intercalator-modified building blocks, intercalator recognizing aptamers with blinking features or implementation of the DNA-PAINT method into live cell imaging using biorthogonal chemistry will certainly have a great impact on nucleic acid research and super-resolution imaging applications, respectively. We will present our results in highly impacted journals as well as at national and international conferences. The project is an excellent platform for young researchers in order to get acquainted with or further their knowledge in the field of chemical biology. The project can serve enough synthetic results for a graduate student in order to obtain a PhD degree or for a post-doctoral fellow to be employed on the project to establish early stage carrier. Besides the PI, another senior fellow is also involved in the project who is responsible for the biological tasks. Furthermore, this research topic is an excellent opportunity for undergraduates who are to be involved in the proposed work while pursuing their degrees. Last, but not least, besides its international significance, to the best of our knowledge, this will be the very first topic in Hungary that involves basic research on DNA-PAINT-method development, which upon success, can be patented as a remarkable development suitable for super-resolution microscopy.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
Nobel-prize winning innovations in microscope technology enable routine observation of biomolecular processes in details, never seen before. These so-called super-resolution microscopy (SRM) methods utilize light emitting markers to stain the area of interest. While several SRM methods have emerged in the last decade, all suffer from some limitations. One major method that enables precise localization of such light sources relies on the random appearance of sparse fluorescent signals. Existing means to induce such random blinking require external stimuli (chemical, photo), which often prevents the use of such methods from live organisms. Herein we propose a system that allows inherent blinking without the need for any external stimuli. Such a generalizable method allow excellent methodological and diagnostic improvements that may lead in turn to the better understanding of biological processes and consequently to advanced medical diagnostics and drug development.
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
List of publications |
|
|
| Németh E., Knorr G., Németh K., Kele P.: A bioorthogonally applicable, fluorogenic, large stokes-shift probe for intracellular super-resolution imaging of proteins, BIOMOLECULES 10: (3) 397, 2020 | | Török György, Cserép Gergely B, Telek András, Arany Dóra, Váradi Melinda, Homolya László, Kellermayer Miklós, Kele Péter, Németh Krisztina: Large Stokes-shift bioorthogonal probes for STED, 2P-STED and multi-color STED nanoscopy, METHODS AND APPLICATIONS IN FLUORESCENCE, 2020 | | Török György, Cserép Gergely B, Telek András, Arany Dóra, Váradi Melinda, Homolya László, Kellermayer Miklós, Kele Péter, Németh Krisztina: Large Stokes-shift bioorthogonal probes for STED, 2P-STED and multi-color STED nanoscopy, METHODS AND APPLICATIONS IN FLUORESCENCE, 2021 | | Szatmári Ágnes, Cserép Gergely B., Molnár Tibor Á., Söveges Bianka, Biró Adrienn, Várady György, Szabó Edit, Németh Krisztina, Kele Péter: A Genetically Encoded Isonitrile Lysine for Orthogonal Bioorthogonal Labeling Schemes, MOLECULES 26: (16) p. 4988., 2021 | | Albitz, E.; Kern, D.; Kormos, A.; Bojtár, M.; Török, Gy.; Biró, A.; Szatmári, Á.; Németh, K.; Kele, P.: Bioorthogonal Ligation-Activated Fluorogenic FRET Dyads, Angewandte Chemie International Edition https://doi.org/10.1002/anie.202111855, 2022 | | Németh E., Knorr G., Németh K., Kele P.: A bioorthogonally applicable, fluorogenic, large stokes-shift probe for intracellular super-resolution imaging of proteins, BIOMOLECULES 10: (3) 397, 2020 | | Török György, Cserép Gergely B, Telek András, Arany Dóra, Váradi Melinda, Homolya László, Kellermayer Miklós, Kele Péter, Németh Krisztina: Large Stokes-shift bioorthogonal probes for STED, 2P-STED and multi-color STED nanoscopy, METHODS AND APPLICATIONS IN FLUORESCENCE, 2021 | | Szatmári Ágnes, Cserép Gergely B., Molnár Tibor Á., Söveges Bianka, Biró Adrienn, Várady György, Szabó Edit, Németh Krisztina, Kele Péter: A Genetically Encoded Isonitrile Lysine for Orthogonal Bioorthogonal Labeling Schemes, MOLECULES 26: (16) p. 4988., 2021 | | Albitz, E.; Kern, D.; Kormos, A.; Bojtár, M.; Török, Gy.; Biró, A.; Szatmári, Á.; Németh, K.; Kele, P.: Bioorthogonal Ligation-Activated Fluorogenic FRET Dyads, Angewandte Chemie International Edition https://doi.org/10.1002/anie.202111855, 2022 | | Cserép Gergely B, Németh Krisztina, Szatmári Ágnes, Horváth Flóra, Imre Tímea, Németh Krisztina, Kele Péter: Beyond the bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder reactions of tetrazines: 2-pyrone-functionalized fluorogenic probes, SYNTHESIS-STUTTGART 54: (17) pp. 3858-3866., 2022 | | Kormos Attila, Egyed Alexandra, Olvany Jasmine M., Szatmári Ágnes, Biró Adrienn, Csorba Zsóka, Kele Péter, Németh Krisztina: A Bioorthogonal Double Fluorogenic Probe to Visualize Protein-DNA Interaction, CHEMOSENSORS 10: (1) 37, 2022 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
