A p300/HIF-1alpha kölcsönhatást gátló foldamer ligandumok célfehérje által vezérelt evolúciója
Title in English
Target assisted evolution of foldameric ligands against the p300/HIF-1alpha interaction
Keywords in Hungarian
p300/HIF1alpha, hypoxia, foldamer, in vitro evolúció, DNS templátolt szintézis
Keywords in English
p300/HIF1alpha, hypoxia, foldamer, in vitro evolution, DNA templated synthesis
Discipline
Biological Applications of Chemistry (Council of Physical Sciences)
100 %
Panel
Chemistry 2
Department or equivalent
Department of Medical Chemistry (University of Szeged)
Starting date
2020-09-01
Closing date
2023-12-31
Funding (in million HUF)
25.500
FTE (full time equivalent)
3.20
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. Nagy, oldószernek kitett kölcsönhatási felülettel rendelkező, terápiás szempontból fontos fehérje célpontok befolyásolása kismolekulákkal komoly kihívást jelent. Peptidomimetikus szerkezetek alkalmazása megoldást jelenthet, azonban mesterséges szerkezetükből adódóan optimalizálásuk általában időigényes és költséges folyamat, emiatt alternatív módszerek alkalmazására van szükség. Célunk olyan módszerek fejlesztése melyek lehetővé teszik szelektív és erősen kötődő peptidomimetikumok (β-peptid foldamerek) hatékony szintézisét és irányított evolúcióját. Ehhez modellként a p300/HIF-1α kölcsönhatást választottuk, mely fontos szerepet játszik a sejtek hipoxiához való adaptációjában, így a rákos sejtek túlélésében és a betegség progressziójában. Dinamikus kovalens kémia alkalmazásával, mely során a célfehérje szelekciós nyomást gyakorol a keletkező ligandumokra, elősegíthető nagy affinitású, szelektív ligandumok szintézise és azonosítása egy lépésben. DNS szál által vezérelt szintézis használatával a keletkező ligandumok egyedi DNS azonosítóval rendelkeznek, ami lehetővé teszi az azonosításukat több szelekciós lépést követően, ily módon alkalmasak in vitro evolúcióra. Foldamerekből modulárisan felépített ligandumok irányított evolúciós optimalizálása gyorsabb és hatékonyabb stratégiát eredményezhet komplex kölcsönhatások befolyásolására, mely széleskörű érdeklődésre tart számot kémiai biológával foglalkozó kutatók körében.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. Peptidomimetikumok alkalmazása egy gyakori stratégia más módszerekkel nehezen befolyásolható fehérje-fehérje kölcsönhatások gátlására. Azonban az ilyen mesterséges szerkezetek optimalizálása hosszadalmas és költséges folyamat; komplexitásukból adódóan szerkezet-hatás összefüggéseket csak sok analóg szintézisével vagy nagy felbontású szerkezet megfejtésével lehet felállítani. További nehézséget okozhat amennyiben a célfehérje egy rendezetlen szerkezetű ligandummal hat kölcsön, illetve több, egymástól távol eső kötőhellyel rendelkezik. Ilyen kölcsönhatás az általunk célpontként választott p300/HIF-1alfa kölcsönhatás. Első megközelítésben az önmagában rendezetlen szerkezetű HIF-1alfa szekvenciájában végeznénk beta-aminosav helyettesítéséket, azzal a céllal, hogy a stabilitását illetve a kölcsönhatáskor felvett helikális konformációját növeljük, mely a későbbiekben kiindulópont lehet további ligandum tervezéséhez. Alternatív megoldást jelenthet egy olyan módszer mely alkalmas peptidomimetikumok fehérje templát által vezérelt irányított evolúciójára és ily módon nagy affinitású, szelektív ligandum létrehozására. Ezt az evolúciót nem aminosav szintű mutációval, hanem rövid helikális béta-peptid foldamer szakaszok egymáshoz ligálásával kívánjuk létrehozni. A foldamer szakaszok így, egy multivalens ligandum fragmenseinek tekinthető, ezáltak a módszer kiterjeszthető több fehérjére is ugyanazon fragmensek alkalmazásával. Kutatómunkánk során szeretnék megvizsgálni, hogy mely módszer/módszerek alkalmasak egy ilyen rendszer felépítésére és ehhez a ligandumok szintézisét dinamikus kovalens kémia és DNS templáton való szintézis segítségével tervezzük megvalósítani.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! Számos példa ismert béta-peptid foldamerek alkalmazására fehérjék funkciójának befolyásolására, azonban ezeknek a mesterséges oligomereknek a használata nem terjedt el széles körben. A hatékony in vitro molekuláris evolúciós módszerek (pl.: fág-display) nem alkalmazhatók ilyen mesterséges szerkezetek esetén, így alternatív módszerekre van szükség. Mesterséges oligomerek optimalizálása gyakran aminosav szintű mutációt igényel vagy amennyiben rendelkezésre áll, szerkezeti információn alapul. A mi megközelítésünkben már eleve másodlagos szerkezettel rendelkező rövid béta-peptid foldamereket alkalmazunk, mint egy nagyobb multivalens ligandum építőkövei. Gondot jelenthet továbbá peptidomiketikus szerkezetek alkalmazásánál a szelektivitás kérdése, mivel ezek a ligandumok gyakran kevés, hasonló proteinogén oldalláncot tartalmaznak így több célfehérjéhez is képesek kötődni. Ez próbáljuk meg kiküszöbölni azzal, hogy a béta-peptid foldamer fragmenseket a fehérje jelenlétében, azaz szelekciós nyomás hatására hozzuk létre. Ez a megközelítés moduláris, kiterjeszthető különböző fehérje célpontokra akkor is, ha nem áll rendelkezésre előzetes szerkezeti információ. Továbbá, a célpontként választott p300/HIF-1alfa kölcsönhatás egy potenciális támadáspont egyes rákos betegségek esetén, így a kutatómunka során létrejött bármely szelektív, nagy affinitású ligandum kiindulópontja lehet további gyógyszerfejlesztésnek.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. A fehérjék közötti kölcsönhatások elengedhetetlenek a sejtek működéséhez, illetve szerepet játszhatnak egyes betegségek kialakulásában is. Kihívást jelent olyan általános módszerek fejlesztése, melyek terápiás szempontból fontos fehérje-fehérje kölcsönhatások gátlására alkalmas anyagok azonosítását teszik lehetővé. Az ilyen gátlószerek segíthetnek megérteni egy-egy fehérje rendszer működését, vagy kiindulópontjai lehetnek egy további gyógyszer fejlesztéshez. A fehérjék egy nagy területű, oldószernek kitett felszín segítségével ismerik fel egymást. Kismolekulás hatóanyagok az egyik legalkalmasabb gyógyszerjelöltek, azonban ilyen kölcsönhatások esetén gyakran kudarcot vallanak. Alternatív megoldás az úgynevezett peptidomimetikumok alkalmazása, melyek képesek egy fehérje háromdimenziós szerkezetét utánozni. Ilyen szerkezetek mesterséges építőelemekből állnak és komplexitásuk miatt optimalizálásuk hosszadalmas folyamat. A kutatómunkánk során olyan módszereket tervezünk kifejleszteni, melyek alkalmasak lehetnek peptidomimetikus hatóanyagok optimalizálására terápiás szempontból fontos fehérje-fehérje kölcsönhatások gátlására, így alternatív megoldást jelenthetnek olyan betegségek esetén melyekre jelenleg nincsen hatékony terápia.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. Therapeutically relevant protein-protein interactions (PPIs) in which the binding energy is distributed across a large interaction interface are especially challenging to target using small molecules. Peptidomimetics are attractive alternative scaffolds, but often require a lengthy and expensive process for optimization. Hence, there is a need for alternative methodologies that allow iterative affinity maturation of non-natural ligands. In this research program we will explore different methodologies to identify non-natural folding oligomers (β-peptide foldamers) against the HIF-1α/p300 interaction, which plays a key role in the adaption to hypoxia and cancer cell survival, thus it is an attractive target for cancer therapy. A dynamic combinatorial chemistry approach will be employed, that would allow the synthesis and screening of large libraries in a single step under the selection pressure by the protein template. Alternatively, using DNA to program the chemical synthesis of foldameric ligands would allow the creation of libraries where the compounds have their own genetic code, thus can be subjected to cycles of in vitro evolution. We anticipate that using prefolded β-peptide foldamers as building blocks of a more complex ligand in combination with methods that allow in vitro affinity maturation would facilitate faster, more effective strategies to target difficult interfaces and will draw the attention of scientists working in the field of chemical biology.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. The use of peptidomimetics is a well-known approach to target challenging protein-protein interactions, but the optimization of such ligands is usually challenging, often requiring high resolution structural data or several analogs to establish structure-activity relationships. Other difficulties may arise when the interacting partner is an intrinsically disordered protein or the binding site contains spatially separated hot regions. One such interaction is the p300/HIF-1alpha interaction, which we selected as our target to investigate different approaches for the development of high affinity inhibitors. Using beta-amino acid substitutions in the sequence of the intrinsically disordered HIF-1alpha and CITED2 would increase the stability and provide better starting points for further ligand development. In our second approach, instead of mutating the sequences at the amino acid level we use short β-peptide foldamer sequences as fragments of a multivalent ligand. Our hypothesis is that, in combination with methods that allow directed molecular evolution in presence of the target protein as a selection pressure (such as dynamic covalent chemistry or DNA templated synthesis) would provide an efficient way to generate high affinity and selective ligands.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. Although beta-peptides are well known scaffolds to influence protein function, the use of these oligomers are not widespread. Techniques exploiting in vitro molecular evolution (e.g. phage display) are fast and powerful tools but are limited to sequences relying on ribosomal peptide synthesis, which renders the optimization of these non-natural oligomers challenging. Optimization of such ligands usually include mutations at the amino acid level or rely on structure-based design. In our approach we use short, already folded helical beta-peptide segments as building blocks for a multivalent ligand. Selectivity of peptidomimetic ligands can also be a concern, most peptidomimetics contain similar proteinogenic side-chains and tend to bind multiple targets. By using the folded beta-peptide fragments as building blocks and performing the ligand optimization under the selection pressure of the target protein could provide an efficient way to obtain selective ligands. Our approach is modular and can be extended to different protein targets even without prior structural knowledge. Furthermore the p300/HIF-1alpha interaction that we selected as our target for this research program is a promising target for cancer therapy, any high affinity and selective ligand could be a starting point for further drug development.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. Protein-protein interactions (PPIs) control all cellular processes relevant to health and disease, hence an outstanding challenge in chemical biology is to develop generic approaches for PPI inhibition. Such inhibitors represent unique tools to understand biological processes and starting points for drug discovery, for treatment of multiple illnesses for which effective treatments don’t currently exist e.g. cancer. Proteins recognize each other through a large, shallow, less well-defined, convex interaction interface. Small molecules would be ideal therapeutics, but tend to be unsuccessful against these larger, more challenging interfaces. An alternative approach to target these challenging interfaces is the use of peptidomimetics or proteomimetics. These structures consist of non-natural building blocks capable of mimicking the 3D structure required for bioactivity. Our goal is to investigate different approaches and develop methods that ease the identification of non-natural ligands capable of influencing therapeutically relevant protein-protein interactions.
Final report
Results in Hungarian
A kutatóprogram célja peptidomimetikus rendszerek fejlesztése volt a hipoxiában szerepet játszó p300/HIF-1alfa kölcsönhatás gátlására. Béta aminosavak beépítésével feltérképeztük a kölcsönhatás negatív regulátora, a CITED2 fehérje szerkezeti elemeit, melyek a hatékony kompetícióhoz szükségesek. Ez jelentősen hozzájárult a negatív reguláció molekuláris mechanizmusának megértéséhez. Másik megközelítésünkben, mesterséges önrendeződő szerkezetek, foldamer könyvtárak alkalmazásával térképeztük fel a p300 fehérje TAZ1 doménjének felszínét, majd szelektáltunk gyengén kötődő ligandumokat. A foldamer ligandumok továbbfejlesztése érdekében megkíséreltünk kifejleszteni egy in vitro evolúciós módszert. Ehhez sikeresen állítottunk elő ligálható peptid- és foldamer-oligonukleotid konjugátumokat, melyek DNS templát jelenlétében történő ligálás után multivalens ligandumokat eredményeztek.
Eredményeink hozzájárulnak a p300/HIF-1alfa gátló CITED2 molekuláris mechanizmusának megértéséhez, valamink kiindulópontot nyújtanak terápiás célú molekulák kifejlesztéséhez. Szélesebb körben, eredményeink módszereket adnak a sejtfolyamatok irányításában jelentős szerepet játszó, több kötőmotívummal rendelkező rendezetlen fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatához.
Results in English
The research programme focused on the development of peptidomimetic ligands and methods targeting the p300/HIF-1alpha interaction, which plays key role in the hypoxic response. We successfully determined the key binding motifs of the negative regulator CITED2 using beta amino acid replacements. This helped us to understand the molecular mechanism of the effective competition that can be exploited in the design of inhibitory ligands. In our second approach, using libraries of nonnatural folding oligomers (foldamers) we mapped the surface of the TAZ1 domain of p300 and selected folded fragments that bind with low affinity. To improve the affinity and selectivity of the ligands, we attempted to develop an in vitro evolution method for peptidomimetics. We successfully synthesized ligatable foldamer-oligonucleotide conjugates, which were ligated in the presence of a DNA template, resulting in multivalent ligands.
Our results help to understand the underlying molecular mechanism of the negative regulation by CITED2. Furthermore, it provides starting points for therapeutically relevant ligand design. More broadly, our results provide methods to understand protein-protein interactions mediated by intrinsically disordered proteins that have multiple cooperative binding motifs.
