Dezoxinukleozid kinázok szerepe a DNS repair és az apoptózis folyamatában
Title in English
The role of deoxynucleoside kinases in DNA repair and apoptosis
Panel
Cellular and Developmental Biology
Department or equivalent
Dept. of Molecular Biology (Semmelweis University)
Participants
Keszler, Gergely Sasvári, Mária Staub, Mária
Starting date
2004-01-01
Closing date
2009-12-31
Funding (in million HUF)
4.696
FTE (full time equivalent)
0.00
state
closed project
Final report
Results in Hungarian
A genotoxikus anyagok és a besugárzás DNS-károsodást váltanak ki, amelynek szenzora a p53 tumor-szuppresszor fehérje. A kezelések hatására a limfocitákon és a vad típusú p53-at expresszáló DG-75 sejtvonalon többszörös dezoxicitidin-kináz (dCK) aktiválódást észleltünk, ellentétben a p53-at nem expresszáló BL-41 és Ramos sejtekkel. A pifithrin-alfával és a Ca2+-kelátor BAPTA-AM-mel a dCK-aktiválódás felfüggeszthető. Az eredmények azt valószínűsítik, hogy a p53 és a Ca2+ lényeges szerepet játszik a dCK aktiválódásban. Az aktivált enzim stabilabb, immunreaktivitása fokozott a kontroll enziméhez képest. Limitált tripszinolízis segítségével bebizonyítottunk, hogy a dCK aktiválása közben konformáció-változás történik. Az aktivált dCK foszfoprotein-foszfatáz emésztésével, a tisztított dCK kétdimenziós elektroforézisével, valamint affinitás-kromatográfiával elsőként mutattuk ki, hogy a dezoxicitidin-kináz fehérjének legalább 30%-a foszforilált. Azonban a foszforilációs helyek azonosítása tömeg-spektroszkópiai analízissel nem sikerült, valószínűleg az endogén dCK kis mennyisége és az általunk használt tömegspektroszkópiás módszer nem eléggé érzékeny volta miatt. A dAdo is hatékonyan stimulálta a dCK-t, párhuzamosan a sejtek kaszpáz-3-aktivitása és a dATP-pool is szignifikánsan (150-170%) emelkedett, miközben a pirimidin-poolok 30-50%-kal csökkentek. Az eredmények azt bizonyítják, hogy a dCK aktiválódásának fontos szerepe lehet a dAdo-mediálta citotoxicitásban.
Results in English
Both genotoxic agents and irradiation cause DNA damage that activates the p53 tumour suppressor protein. Deoxycytidine kinase (dCK) activity was stimulated several fold in irradiated lymphocytes and in DG-75 cells expressing wild-type p53, but not in p53-/- BL-41 and Ramos cells. Enhancement of dCK activity can be totally released with p53 inhibitors or with the calcium chelator BAPTA-AM. These results suggest that both p53 and Ca2+ play an important role in the activation of dCK.The activated enzyme is more stable and its native immunoreactivity is increased as compared to the control species. Using limited tripsinolysis, we have proven that dCK undergoes a conformational change during activation. We also demonstrated by several assays (phosphoproteine phosphatase digestion, two-dimensional electrophoresis, affinity chromatography) that 30% of the cellular dCK pool is phosphorylated. However, we failed to identify the phosphorylated amino acid residues in the dCK sequence, probably due to the too low amounts of endogenous dCK in cells, and the mass spectrometry method we had used might not have been sensitive enough.
dAdo effectively stimulates dCK, and we could observe parallel activation of caspase 3 and a simultaneous 150-170% increase of the dATP pool, paralleled by 30-50% decrease of pyrimidine pools. These results underline the importance of dCK activation in the mechanism of dAdo-mediated cytotoxicity.
2. Keszler G, Spasokoukotskaja T; Csapo Zs; Talianidis I; Eriksson S; Staub M; Sasvari-Szekely M.: Activation of deoxycytidine kinase in lymphocytes is calcium dependent and involves a conformational change detectable by native immunostaining, Biochem Pharmacol 67: 947-955, 2004
3. Keszler G; Spasokoukotskaja T; Virga S; Sasvari-Szekely M; Staub M.: Stimulation of deoxycytidine kinase results in prolonged maintenance of the enzyme activity, Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 23: 1357-1361, 2004
4. Keszler G., Virga S., Spasokoukotskaja T., Bauer P.I., Sasvari-Szekely M., Staub M: Activation of deoxycytidine kinase by deoxyadenosine: Implications in deoxyadenosine-mediated cytotoxicity., Archives Biochem. Biophys 436, 69-77, 2005
1. Keszler G., Spasokoukotskaja T., Csapó Zs. , Virga S., Staub M., Sasvari-Szekely M.: Selective increase of dATP pools upon activation of deoxycytidine kinase in lymphocytes: Implications in apoptosis, Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 23, 1335-1342, 2004
6. Spasokoukotskaja T; Csapo Z; Virga S; Sasvari-Szekely M; Staub M; Keszler G: Effect of intracellular calcium chelation and pifithrin-a on deoxynucleotide metabolism in human lymphocytes, Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 25, 1181-1184, 2006
5. Keszler G; Spasokoukotskaja T; Sasvari-Szekely M: Deoxycytidine kinase is reversibly phosphorylated in normal human lymphocytes, Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 25, 1147-1151, 2006
7. Spasokoukotskaja T; Csapo Z; Virga S; Sasvari-Szekely M; Staub M; Keszler, G: A novel effect of pifithrin-alpha, a potent p53 inhibitor, on nucleoside metabolism in human lymphocytes, 20th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology and 11th FAOBMB Congress, June 18-23, Kyoto, Japan, Abstracts p.151, 2006
8. Szatmari T; Huszty G; Désaknai S; Spasokoukotskaja T; Sasvári-Székely M; Staub M; Staub M; Ésik O; Sáfrány G; Lumniczky K: Adenoviral vector transduction of the human deoxycytidine kinase gene enhances the cytotoxic and radiosensitizing effect of gemcitabine on experimental gliomas, Cancer Gene Therapy 15, 154–164, 2008
9. Spasokoukotskaja T; Szatmari T; Huszty G; Désaknai S; Sáfrány G; Lumniczky K: Radiosensitizing effect of gemcitabine on dCK-transduced experimental gliomas, 7th International Meeting on the Effects of Low Doses of Radiation in Biological Systems; November 27-29, Lisbon, Portugal; P2.4 Programme and Book of Abstracts p. 120, 2008
