The Role of Protein Kinase C and Calcineurin Signalling Pathways in Chondrogenesis  Page description

Help  Print 
Back »
 

Details of project

  
Identifier
60620
Type K
Principal investigator Gergely, Pál
Title in Hungarian Protein kináz C és kalcineurin jelátviteli pályák szerepe a kondrogenézisben
Title in English The Role of Protein Kinase C and Calcineurin Signalling Pathways in Chondrogenesis
Keywords in Hungarian transzkripciós faktorok (CREB, NFAT, Sox9, NFkB), sejtpermeábilis toxinok, mezenchimális sejtek
Keywords in English transcription factors (CREB, NFAT, Sox9, NFkB), cell-permeable toxins, mesenchymal cells
Discipline
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)60 %
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)40 %
Panel Molecular and Structural Biology and Biochemistry
Department or equivalent Department of Medical Chemistry (University of Debrecen)
Participants Bakó, Éva
Czifra, Gabriella
Módis, László
Zákány, Róza
Starting date 2006-02-01
Closing date 2010-01-31
Funding (in million HUF) 19.904
FTE (full time equivalent) 4.29
state closed project
Summary in Hungarian
Vizsgálatainak középpontjában egyes protein kináz és foszfatáz enzimeknek a porcképződés szabályozásában betöltött szerepe áll. Kísérleti modellünk csirkeembriók végtagtelepeiből előállított primer, porcosodó high density mesenchymális sejtkultúra, melyben a porcképződés valamennyi fázisa spontán lezajlik 6 nap alatt, így a folyamat során bekövetkező intracelluláris történések és a porcmatrix változásai jól nyomon követhetők. Tervezett kísérleteink során vizsgálni kívánjuk: 1. Az intracelluláris kalciumion koncentrációváltozásokat, kalcium ionoforok alkalmazását követően a kalcineurin és egyes PKC izoenzimek expressziójának és aktivitásának változásait, illetve ezek hatását a porcképződés markereire. 2. Kalcineurin, PP2A, PKCmű, delta és zéta izoenzimek konstitutive aktív és inaktív variánsainak tranziens transzfekciójával előállított kultúrákban vizsgáljuk a porcdifferenciáció változásait, a porcosodó sejtek különböző életfunkcióit, a CREB, NFAT, Sox9 és NFkB transzkripciós faktorok expressziójának, foszforilációjának változásait. 3. PKCmű, delta és zéta izoenzimek tranziens transzfekciójának és/vagy gátlásának hatását a kalcineurin és a PP2A expressziójára és aktivitására, valamint a többi PKC izoenzim funkcióira. 4. A kalcineurin és a PP2A tranziens transzfekciójának és/vagy gátlásának hatását a PKCmű, delta és zéta izoenzimek aktivitására, illetve expressziójára, továbbá a foszfatázok egymásra gyakorolt hatásait.
Summary
We have published some data on the role of different protein phosphatases in the regulation of chondrogenesis. Our experimental model is the primary chondrogenic high-density mesenchymal cell culture (HDC), established from the limb buds of 4-day-old chicken embryos. Since chondrogenesis occur spontaneously in this model within six days, thus intracellular events and changes of the extracellular matrix can be easily detected. In the research proposal the following investigations are outlined. 1. Measurement of intracellular concentrations of calcium during the onset of chondrogenesis following application of calcium ionophors, as well as investigation of the effects of Ca-ionophors on the expression and activities of PP2B (calcineurin), PP2A, PKC isoenzymes, and transcription factors such as CREB, NFAT, NFkB and Sox9 in HDCs. 2. Detection of changes in cartilage formation, biological functions, expression and phosphorylation of CREB, NFAT, NFkB and Sox9 in HDCs transiently transfected with constitutive active and inactive variants of PP2B, PP2A, PKCmu, delta and zeta. 3. Effects of transient transfection and/or inhibition of PKCmu, delta and zeta on the expression and activity of PP2A, PP2B and other PKC isoenzymes; as well as the effects of above PKC isoenzymes on each other. 4.Effects of transient transfection and inhibition of PP2A and/or PP2B on the expression and activity of different PKC isoenzymes and also the effects of these phosphatases on each other.




 

Final report

  
Results in Hungarian
Az egyik legáltalánosabban elterjedt in vitro porcdifferenciációs modell a négy napos csirkeembriók végtagtelepeiből izolált, chondroprogenitor mesenchymalis sejtekből álló primer high density sejttenyészet (HD). Kimutattuk, hogy a HD-kultúrákban karakterisztikus Ca2+-koncentráció-változások detektálhatók a differenciálódással párhuzamosan, ami nélkülözhetetlen a porcképződésben. A chondrogenikus sejtek ATP-t szekretálnak és a HD sejttenyészethez adott ATP Ca2+-tranzienseket vált ki. Igazoltuk a P2X4 ionotrop purinerg jelátviteli folyamatok jelentőségét az ATP-függő Ca2+-tranziensekben. A protein kináz C izoenzimei közül elsősorban a PKCdelta játszik szerepet a HD sejtek differenciációjában. A PKCdelta aktivitásának specifikus gátlásával, vagy géncsendesítésével kimutattuk, hogy az enzim a Sox9 és ERK1/2 foszforilációjával járul hozzá a porcképződés fokozásához. Igazoltuk, hogy az oxidatív stressz fokozza a HD-kultúrák sejtjeiben a poli(ADP-ribozil)áció metabolizmust, ami végső soron a porcképződés csökkenéséhez vezet. Adataink arra is utalnak, hogy a poli(ADP-ribóz) glikohidroláz (PARG) súlyos oxidatív károsodás esetén a nekrotikus sejthalált apoptótikus irányba tereli, habár, gyenge DNS károsodás esetén fokozza a sejtek apoptózissal szembeni érzékenységét. Eredményeink felvetik a PARP-1 és PARG célpontok jelentőségét a chondrogenikus sejtek extracelluláris mátrix képződésében.
Results in English
High-density cell culture (HDC) established from chondrogenic mesenchymal cells isolated from limb buds of 4-day old chicken embryos is a well-known model of in vitro cartilage differentiation. We have demonstrated that elevation of free cytosolic Ca-concentration at the time of differentiation of chondroblasts was mainly due to a Ca-influx and it was indispensable to cartilage formation in HDC. We also reported that chondrogenic cells secreted ATP and administration of ATP to the culture medium evoked Ca-transients. As a consequence we suggest a role of ionotropic purinergic signalling of P2X4 in the generation of ATP-dependent Ca-transients. Several isoenzymes of protein kinase C (PKC) play a role in the differentiation of HDC, especially PKCdelta. The inhibition of PKCdelta activity and gene silencing demonstrated that this enzyme is crucial in the stimulation of chondrogenesis via influencing Sox9 and ERK1/2 phosphorylation. We also demonstrated that oxidative stress stimulated poly(ADP-ribose) metabolism and inhibited extracellular matrix production of HDC in a poly(ADP-ribose) polymerase- dependent manner. Our data indicates that poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) is a survival factor at excessive oxidative damage by driving necrotic cell death to apoptotic pathway. Our findings may have implications for potential therapeutic approaches aimed at restoring the matrix production capacity of chondrogenic cells.
Full text https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=60620
Decision
Yes





 

List of publications

  
Matta, Cs., Fodor, J., Szíjgyártó, Zs., Juhász, T., Gergely, P., Csernoch, L.,Zákány, R.: Cytosolic free Ca2+ concentration exhibits a characteristic temporal pattern during in vitro cartilage differentiation: a possible regulatory role of calcineurin in Ca-si, Cell Calcium, 2008
Fodor, J., Matta, Cs., Juhász, T., Oláh, T., Gönczi, M., Szíjgyártó, Zs., Gergely, P., Csernoch, L., Zákány, R.: Ionotropic purinergic receptor P2X4 is involved in the regulation of chondrogenesis in chicken micromass cell cultures, Cell Calcium 45, 421-430, 2009
Zákány, R., Bakondi, E., Juhász, T., Matta, Cs., Szíjgyártó, Zs., Erdélyi, K., Szabó, É., Módis, L., Virág, L., Gergely, P.: Oxidative stress-induced poly(ADP-ribosyl)ation in chick limb bud-derived chondrocytes, Int. J. Mol. Med., 2007
Erdélyi, K., Bai, P., Kovács, I., Szabó, É., Mocsár, G., Kakuk, A., Szabó, Cs., Gergely, P., Virág, L.: Dual role of poly(ADP-ribose) glycohydrolase in the regulation of cell death in oxidatively stressed A549 cells, FASEB J. 23, 3553-3563, 2009
Szíjgyártó, Zs., Szűcs, K., Kovács, I., Zákány, R., Sipka, S., Gergely, P.: The role of protein kinase C isoenzymes in the regulation of calcineurin activity in human peripheral blood mononuclear cells, Int. J. Mol. Med., 2007
Kiss, A., Lontay, B., Bécsi, B., Márkász, L., Oláh, É., Gergely, P., Erdődi, F.: Myosin phosphatase interacts with and dephosphorylates the retinoblastoma protein in THP-1 leukemic cells: its inhibition is involved in the attenuation of daunorubicin-i, Cellular Signalling, 2008
Kakuk, A., Friedlander, E., Vereb, Gy. Jr., Lisboa, D., Bagossi, P., Tóth, G., Gergely, P., Vereb, Gy.: Nuclear and nucleolar localizatoin signals and their targeting function in phosphatidylinositol 4-kinase PI4K230, Exp. Cell Res., 2008
Juhász, T., Matta, Cs, Veress, G., Nagy, G., Szíjgyártó, Zs., Molnár, Zs., Fodor, J., Zákány, R., Gergely, P.: Inhibition of calcineurin by cyclosporine A exerts multiple effects on human melanoma cell lines HT168 and WM35, Int. J. Oncology 34, 995-1003, 2009
Kolozsvári, B., Szíjgyártó, Zs., Bai, P., Gergely, P., Verin, A., Garcia, J.G.N., Bakó, É.: Role of calcineurin in thrombin-mediated endothelial cell contraction, Cytometry Part A, 75A, 405-411, 2009
Benltifa, M., Vidal, S., Fenet, B., Msaddek, M., Goekjian, P.G., Praly, J-P., Brunyánszki, A., Docsa, T., Gergely, P.: In search of glycogen phosphorylase inhibitors: 5-substituted 3-C-Glucopyranosyl-1,2,4-oxadiazoles from beta-D-glucopyranosyl cyanides upon cyclization of O-acylamidoxime, Eur. J. Org. Chem., 2006
Tóth, M., Kun, S., Bokor, É., Benltifa, M., Tallec, G., Vidal, S., Docsa, T., Gergely, P., Somsák, L., Praly, J-P.: Synthesis and structure-activity relationships of C-glycosylated oxadiazoles as inhibitors of glycogen phosphorylase, Bioorganic and Medicinal Chemistry 17, 4773-4785, 2009
Bertus, P., Szymoniak, J., Jeanneau, E., Docsa, T., Gergely, P., Praly, J-P., Vidal, S.: Synthesis of a C-glucosylated cyclopropylamide and evaluation as a glycogen phosphorylase inhibitor, Bioorg. Med. Chem. Lett., 2008
Cecioni, S., Argintaru, O-A., Docsa, T., Gergely, P., Praly, J-P., Vidal, S.: Probing multivalency for the inhibition of an enzyme: glycogen phosphorylase as a case study, New J. Chem. 33, 148-156, 2009



Back »