A XIII-as véralvadási faktor A és B alegységének kapcsolódásáért felelős struktúrális elemek azonosítása a B alegységben
Title in English
Identification of the binding domain(s) involved in the binding with FXIII-A on FXIII-B
Keywords in Hungarian
véralvadás, XIII-as faktor, Sushi domén
Keywords in English
blood coagulation, factor XIII, Sushi domain
Discipline
Haematology, immunology, thrombosis, infectious diseases (Council of Medical and Biological Sciences)
50 %
Haematology, immunology, thrombosis, infectious diseases (Council of Medical and Biological Sciences)
30 %
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)
20 %
Panel
Clinical Medicine
Department or equivalent
Department of Human Genetics (University of Debrecen)
Starting date
2006-02-01
Closing date
2009-01-31
Funding (in million HUF)
6.749
FTE (full time equivalent)
1.38
state
closed project
Summary in Hungarian
A XIII-as véralvadási faktor A és B alegységének kapcsolódásáért felelős struktúrális elemek azonosítása a B alegységben
A véralvadás XIII-as faktora (FXIII) két potenciálisan aktív A és két protektív/inhibítor jellegü B alegységből felépülő heterotetramer (FXIIIA2B2). Aktív formájának fő fiziológiás funkciója a fibrin láncok keresztkötése. A FXIII deficiens betegek súlyos vérzékenységben szenvednek. A FXIII-B egyetlen ismert biológiai funkciója a FXIII-A-hoz való kötődés. A FXIII-B szinte kizárólag ún. Sushi (másnéven Complement Control Protein (CCP) vagy Short Consensus Repeat (SCR)) doménekből áll. A két alegység kapcsolódása, az abban résztvevő elemek nem ismertek. E pályázat célja az A és B alegységek kapcsolódásáért felelős domén(ek) felderítése a FXIII-B alegységben. Rekombináns FXIII-B mutánsokat alakítanék ki oly módon, hogy a FXIII-B C-terminálisáról kiindulva a Sushi doméneket kettesével deletálom, és a klónozott trunkált FXIII-B mutánsokat expresszálom. A trunkált FXIII-B mutánsok mellett szubsztitúciós mutánsokat hoznék létre, ahol az individuális doméneket más fehérjéből származó doménnel helyettesíteném. A rFXIII-B mutánsok FXIII-A kötési képességét különböző chip, gél, illetve mikrolemez alapú módszerekkel vizsgálnám.
Summary
Identification of the binding domain(s) involved in the binding with FXIII-A on FXIII-B
Blood coagulation factor XIII (FXIII) is composed of two potentially active A subunits and two protective/inhibitory B subunits (FXIIIA2B2). Main physiological function of its active form is to crosslink fibrin chains. Inherited deficiency of FXIII results in serious bleeding. The only known biological function of FXIII-B is the binding to FXIII-A. This protein is composed of almost exclusively of so-called Sushi (Complement Control Protein (CCP) or Short Consensus Repeat (SCR)) domains. The detail of the binding of the two subunits is unknown. Main goal of this project is to identify the domains responsible for the binding to FXIII-A on FXIII-B. Two main settings are planned, the generation of deleterious mutants and substitution mutants using FXIII-B cDNA as template. In the former, I will delete the Sushi domains in twos starting from the C-terminal and in the latter I will substitute the individual domains with a domain cloned from another protein. After expressing the mutant recombinant construct, using various chip-, gel- and microplate based methods the details of the binding will be investigated.
Final report
Results in Hungarian
1. rFXIII-B. Máj cDNS könyvtárból klónoztam a teljes hosszúságú FXIII-B cDNS-t és előállítottam a 2, 4, 6, 8 Sushi domént tartalmazó mutánsokat. Az optimalizált expressziós rendszer a COS-7-DEAE-dextrán kombináció volt. A médiumból a rFXIII-t és mutánsait Ni-kromatográfiával részlegesen tisztítottam nem denaturáló körülmények között. A fehérjékben a diszulfid hidak kialakultak és a rekombinánsok molekulasúlya jól korrelált a várttal. A stabilitás vizsgálat során degradáció nem volt kimutatható.
2. rFXIII-A. A FXIII-A cDNS-t klónoztam és pET vektorba inzertáltam. A benne levő Shine-Dalgarno szekvenciát megszüntettem. Az expressziós kísérletek nem sikerültek. Ezután maltóz-kötő fehérjével fúzióban próbáltam meg a rFXIII-A-t expresszálni, de sem peri- sem citoplazmatikus esetben nem sikerült a rFXIII-A előállítása. Ezután a rFXIII-A esetében is pcDNA emslő rendszert használtam az expresszióra. Ni-oszlopon a sejtlizátumból történő tisztítás után a rFXIII-A kimutatható volt.
3. Az alegységek kötődésének vizsgálata. A mikrolemezre rögzített rFXIII-A-hoz hozzáadva a rFXIII-B-t és deléciós mutánsait, minden esetben kaptam a kötődésre utaló jelet, mely a lekötött rFXIII-A mennyiségének függvénye volt. Fordított esetben is hasonló eredményt kaptam, azaz a lerögzített rFXIII-B és deléciós mutánsai a rFXIII-A-t kötik. Ez a megfigyelés még további megerősítést igényel, de az eredmények arra utalnak, hogy a FXIII-B N-terminálisa vesz részt a FXIII-A kötésben.
Results in English
1. rFXIII-B. The cDNA of FXIII-B was cloned from liver cDNA library and the deletion mutants containing 2, 4, 6 and 8 Sushi domains were generated. The optimized expression system used COS-7 cells and DEAE-dextran for transfection. For partial purification of the recombinants Ni-chromatography was used under mild conditions. Disulphide bridges were formed and the molecular weight of the recombinants correlated well with the calculated ones. No degradation was observed after prolonged storage period at 4°C.
2. rFXIII-A. The cDNA of FXIII-A was cloned and inserted into pET vector. Although the Shine-Dalgarno sequence was abolished, no rFXIII-A could be detected. After subloning into maltose-binding fusion system, rFXIII-A production was unsuccessful both in the periplasm and in the cytoplasm. Final attempt was to clone cDNA into pcDNA vector and express it in mammalian cell line. rFXIII-A could be detected from the cell lysate after partial purification on Ni-column.
3. Testing the binding of the subunits. When rFXIII-A was coated into the microplate and the rFXIII-B and its mutants were added, rFXIII-B-specific signal could be detected, which was proportionate to the amount of coated rFXIII-A. The reversed setting, where rFXIII-B and its mutants were coated yielded similar results. These observations, though preliminary, suggest that the N-terminal region of FXIII-B is responsible for the binding of FXIII-A.
Balogh I, Dzsudzsak E, Ajzner E, Fekete A, Csapo A, Kappelmayer J.: Generation and expression of recombinant FXIII-B mutants, XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, P-T-047, 2007
Nagy B Jr, Csongradi E, Bhattoa HP, Balogh I, Blasko G, Paragh G, Kappelmayer J, Kaplar M.: Investigation of Thr715Pro P-selectin gene polymorphism and soluble P-selectin levels in type 2 diabetes mellitus., Thromb Haemost 2007;98:186-91., 2007
Takács L, Losonczy G, Matesz K, Balogh I, Sohajda Z, Tóth K, Fazakas F, Vereb G, Berta A.: TGFBI (BIGH3) gene mutations in Hungary--report of the novel F547S mutation associated with polymorphic corneal amyloidosis., Mol Vis 2007;13:1976-83., 2007
Erdos M, Alapi K, Balogh I, Oroszlán G, Rákóczi E, Sümegi J, Maródi L.: Severe Shwachman-Diamond syndrome phenotype caused by compound heterozygous missense mutations in the SBDS gene., Exp Hematol. 2006;34:1517-21., 2007
Balogh I, Dzsudzsak E, Ajzner E, Fekete A, Csapo A, Kappelmayer J.: Rekombináns FXIII-B mutánsok előállítása és expressziója emlős rendszerben, A Magyar Thrombosis és Haemostasis Társaság IX. Kongresszusa, Alsópáhok, 2007
Fekete A, Dzsudzsak E, Ajzner E, Csapo A, Kappelmayer J, Balogh I: Cloning, generation and mammalian expression of recombinant blood coagulation factor XIII-B mutants with deleted Sushi-domains from the C-terminal, in preparation, 2009
Losonczy G, Fekete A, Vokó Z, Takács L, Káldi I, Ajzne E, Kasza M, Vajas A, Berta A, Balogh I: Analysis of CFH Y402H, LOC387715, HTRA1 polymorphisms and ApoE alleles with susceptibility to age related macular degeneration in Hungarian patients, accepted, 2009
Events of the project
2024-03-06 15:22:55
Kutatóhely váltás
A kutatás helye megváltozott. Korábbi kutatóhely: ÁOK Laboratóriumi Medicina Intézet (Debreceni Egyetem), Új kutatóhely: ÁOK Humángenetikai Tanszék (Debreceni Egyetem).
