calpains, calpain substrates, protein phosphorylation, Drosophila mutants, enzyme targeting, transfection, S2 and COS7 cells
Discipline
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)
45 %
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)
40 %
Molecular and cellular neuroscience (Council of Medical and Biological Sciences)
15 %
Panel
Molecular and Structural Biology and Biochemistry
Department or equivalent
Institute of Enzymology, BRC, Hungarian Academy of Sciences
Participants
Ádám, Géza Alexa, Anita Ildikó Béldi, Melinda Bozóky, Zoltán Deák, Péter Dombrádi, Viktor Farkas, Attila Gausz, János Hudecz, Ferenc Kókai, Endre Némethné Szabó, Beáta Papp, Rozália Pop, Ferenc Tantos, Ágnes Tompa, Péter Világi, Ildikó
Starting date
2006-02-01
Closing date
2010-06-30
Funding (in million HUF)
105.000
FTE (full time equivalent)
34.69
state
closed project
Summary in Hungarian
Összefoglalás
A tervezett kutatás célja olyan molekuláris mechanizmusok felderítése, melyek a biológiai plaszticitás (képlékenység) alapját adják. A képlékenység az élő anyag alkalmazkodását, alakíthatóságát jelenti a külső és belső ingerekhez, ami az élő legfőbb jellemzője. A plaszticitás különös hangsúlyt kap az idegrendszerben, annak kifejlődésétől a felnőttkori tanulási és memóriafolyamatokig. A sejtekben működő számos jelpálya közül kettőt választottunk ki: a kalpain proteolitikus rendszert és a fehérje-foszforilációs rendszert (protein kinázok és foszfatázok). Bár mindkettőről már sokat tudunk, kölcsönhatásaik egymással nincsenek tisztázva. A normál életfunkciókon túl, kísérleteinknek patológiai vonatkozásai is vannak, így pl. a neurodegeneráció és a sejtszaporodás szabályozása terén. Az emlős rendszerek mellett vizsgáljuk ezen szabályozó rendszerek működését az ecetmuslicában, a Drosophila melanogasterben, mint modell-szervezetben. Munkánk tehát multi-diszciplináris, evolúciós perspektívába helyezett megközelítése bizonyos plasztikus életfolyamatoknak, melyben felhasználjuk a biokémia, biofizika, molekuláris és sejt-biológia, genetika, neurobiológia, fizikai és szerves kémia, továbbá különböző képalkotó eljárások fogalom és eszköztárát. A feladatok elvégzésére összeállt csapat, kompetens szakemberekből áll, ami a sikeres megvalósítás zálogának tekinthető.
Summary
The goal of the proposed research is to promote understanding, at the molecular level, of life processes and their plasticity. This term denotes adaptation of living matter to external and internal stimuli. It is particularly important in most aspects of the nervous system, from development to adult-stage learning and memory processes. Of the many chemically signalling entities that operate in living cells, we have chosen two enzyme systems that seem to interact with each-other: The system of calpains, the cytoplasmic calcium-activated proteases, and the protein phosphorylation system, i.e. protein kinases and phosphatases. Though much is known about both, their interrelations are ill understood. While calpains and protein kinases/phosphatases are but part of the story, we may claim that these regulatory measures are involved in all plastic life processes. When studying these enzyme systems in vivo, attention will be paid to pathological ramifications, in particular neurodegeneration and control of cell proliferation. Besides mammalian systems, we also analyze the counterparts in the fruit fly, Drosophila melanogaster, as a simpler model organism. Thus we embark on a multidisciplinary approach utilizing methods and concepts of biochemistry, biophysics, molecular biology, cell biology, genetics, neurobiology (electrophysiology, behaviour), physical and organic chemistry and various imaging techniques. Our team includes competent scientists for all these disciplines.
Final report
Results in Hungarian
1. Bizonyítottuk, hogy a kalpain B aktív és inaktív formája foszforilálható PKA, ERK1 és ERK2 kinázokkal, azonosítottuk az in vitro foszforilációs helyeket, és meghatároztuk a foszforilált fehérje megváltozott enzimológiai paramétereit.
2. Előállítottuk az összes Drosophila kalpain elleni antitestet.
3. Kidolgoztunk egy háromdimenziós elektroforetikus eljáráson alapuló, in vivo szubsztrát azonosításra használható módszert, amelynek segítségével számos kalpain szubsztrátot azonosítottunk.
4. Kifejlesztettünk egy sejtpenetráns, szintetikus kalpain szubsztrátot, amely a jelenleg ismert szubsztrátok közül a legérzékenyebb.
5. Kifejlesztettünk egy sejtpenetráns, szintetikus kalpain-aktiváló peptid párt, amely a kalpainok sejten belüli, calcium-mentes és specifikus aktiválására képes.
6. Kimutattuk, hogy patkány hippokampális agyszeletekben a kalpainok specifikus aktiválása az alap-ingerlékenység és az LTP szignifikáns növekedését idézi elő.
7. Kalpain A, kalpain B és kalpain A/B mutáns Drosophila vonalakat állítottunk elő. Elemeztük a fehérjék expresszióját vad és mutáns vonalakban, továbbá vizsgáltuk a fenotípusra gyakorolt hatásukat. A kalpain B fehérjéről megállapítottuk, hogy fontos szerepet játszik a határsejtek vándorlásában.
8. Drosophila kalpain interferencia vonalakat állítottunk elő: a kalpain B csendesített vonalak egyedei csökkent fertilitásúak voltak, a kettős mutánsok szintetikus szemiletalitást mutattak. A kalpain C hiánya letalitást okozott.
Results in English
1. We provided evidence that both the active and inactive forms of calpain B can be phosphorylated by PKA, ERK1 and ERK2. Phosphorylation sites were localized and the enzymological parameters of the modified enzymes were determined.
2. Antibodies have been generated against all forms of Drosophila calpain.
3. A new three-dimensional electrophoresis method has been developed to identify calpain substrates in vivo. Several novel substrates have been identified.
4. A synthetic, cell-permeable synthetic calpain susbtrate has been developed. This compound is more sensitive to the enzyme than any other known calpain substrate.
5. A peptide pair capable of calpain activation have also been developed. These sythetic peptides can penetrate cells and activate the enzyme in a calcium-independent manner.
6. It has been shown that specific activation of calpain(s) leads to a significantly incerased basal excitability and long-term potentiation (LTP) in rat hippocampal slices.
7. Drosophila lines mutant in calpain A, calpain B and calpain A/B have been generated. The effect of changes in calpain expression on phenotype was tested and it was found that calpain B plays a major role in regulating the migration of border cells.
8. Interference strains of Drosophila have also been generated. We found that silencing calpain B causes reduced fertility whereas double mutation causes synthetic semilethality. Calpain C deficit was found to be lethal.
Banoczi Z, Tantos A, Farkas A, Tompa P, Friedrich P, Hudecz F.: Synthesis of Cell-Penetrating Conjugates of Calpain Activator Peptides, Bioconjug Chem., 2007
Világi I, Kiss DS, Farkas A, Borbély S, Tárnok K, Halasy K, Bánóczi Z, Hudecz F, Friedrich P.: Synthetic calpain activator boosts neuronal excitability without extra Ca2+, Mol Cell Neurosci., 2008
Bánóczi Z, Alexa A, Farkas A, Friedrich P, Hudecz F.: Novel cell-penetrating calpain substrate, Bioconjug. Chem., 2008
Bozoky Z, Alexa A, Dancsok J, Gogl G, Klement E, Medzihradszky KF, Friedrich P.: Identifying calpain substrates in intact S2 cells of Drosophila, Arch. Biochem. Biophys., 2009
Kovacs L, Alexa A, Klement E, et al: Regulation of calpain B from Drosophila melanogaster by phosphorylation, FEBS JOURNAL, 2009
Toke O, Banoczi Z, Tarkanyi G, et al.: Folding transitions in calpain activator peptides studied by solution NMR spectroscopy, JOURNAL OF PEPTIDE SCIENCE, 2009
